实验推荐——分子标记技术AFLP

实验方法原理：

AFLP 是RFLP与PCR两种技术的优点相结合的产物，它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害 和 RAPD 稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点；同时具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。

其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1—3个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增，，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

本 AFLP 技术主要特点 ：分析所需DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；

AFLP 技术被认为是一种十分理想、有效的分子标记。

实验材料：

1.1           样品保存与运输

实验步骤：

1.2           DNA 提取（实验方法视DNA来源而异，此处以普通植物样本为例）

CTAB法提取

1） 称取材料50mg，液氮研磨三至四次

2） 将粉末放到装有800µl 2×CTAB提取缓冲液的2ml离心管中

3） 加入60µl巯基乙醇混匀，60度预热30min

4） 其间混匀二至三次取出样品于室温放置

5） 待样品冷却到室温加入800µl氯仿：异戊醇（24：1）

6） 振荡混匀，12000rpm离心15min

7） 取上清到一新2ml离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混匀，12000rpm离心15min

8） 取上清到一新2ml离心管中加入1.5倍体积1×CTAB沉淀液，放置20-30min，12000rpm离心15min

9） 将沉淀晾干溶于200µl TE-buffer（溶解）

10）      加入400 µl 95% 乙醇，20µl  3M NaAC, -20 ℃ 沉淀1小时

11）      4℃ 离心，12000rpm离心15min

12）      500µl 75%乙醇洗涤，12000rpm离心10min

13）      加入30-50µl TE-buffer

14）      0.8％琼脂糖凝胶电泳检测

备注：CTAB法主要针对植物基因组DNA的提取，其它样品：如动物组织、细胞、菌体等公司有相关试剂盒。

1.3           限制性酶切及连接反应

反应体系

混匀离心数秒 37℃保温5h ，8℃保温4h，4℃过夜。

-20℃保存，作为预扩增模板

1.4  预扩增

反应体系

离心数秒,按下列参数进行PCR扩增

94℃  2min

       94℃  30S

       56℃  30S，      30 cycles

      72℃  80S

    72℃  5min

    4 ℃

1.5 选择性扩增

预扩产物1:20稀释后作为选扩模板

按以下体系混匀后，离心数秒

按下列参数设置PCR循环

1）   第一轮扩增参数：94℃  30S，  65℃  30S，  72℃  80S

2）   以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮。

3）   接着按下列参数扩增23轮

94℃  30S，

55℃  30S         23 Cycles

72℃  80S

4)  72℃   5min

 5） 4 ℃

1.6实验结果

ABI377测序仪电泳检测。数据通过GENESCAN软件进分析。

电泳图谱

峰图

原始数据

01数据

遗传聚类图

实验说明：

1.7 数据分析说明

1） ROX500分子量内标

      ROX500为ROX红色荧光标记的分子量内标，从小到大，片段大小依次为：70、80、90、100、120、140、160、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、490、500（bp），共25条带。

2） 原始数据

  公司为客户提供ABI377测序仪电泳检测后的片段大小，即原始数据。数据是通过GENESCAN软件进分析，软件每2个碱基读一次数，Marker片段范围为 70-500bp，这样在70-500 bp之间一共读取216个数，由于不可避免的误差，在所设置的片段Bin Range范围内的片段，认为是同一条带，例如：在71.5-73.5 之间，c1 、c2扩增条带大小分别为73.00835 和71.9044，这样的误差范围在我们的误差允许范围认为是同一条带。

2）01数据

      在原始数据的基础上，有带的地方替换为1，无带的地方替换为0，这样构成了01数据，同时给客户发一份所有01数据汇总后的总数据。

由于软件要求，我们一般都会给客户把数据处理成NTSYSpc2.1 这个软件要求的标准的01数据格式即01总数据。01总数据中 r1-r216 表示第一个引物，r217-r432 代表第二个引物和01分数据一一对应。

如： 一共有8个引物：a-1、a-2、a-3、b-1、b-2、c-1、d-1…….等，在总数据中按顺序排列：

   R1-  r216 的数据为：a-1 这个引物的数据

   R217-r432 的数据位：a-2 这个引物的数据……..，以此类推。

常见问题：

 1）客户委托公司做实验服务，客户需要做哪些工作？

    客户只需提供实验材料，我们负责DNA提取及后续全部试验。收到样品后，我们一般会给客户做预实验，根据客户预实验结果，客户满意度，决定是否安排后续实验。公司现有64个引物组合，全部为FAM荧光标记，我们会从中筛选条带清晰、多态性较好的引物组合给客户。在开始正式实验前，客户需支付课题服务一半的费用，余款在公司给客户发送最后一批数据前，一次结清。

2) 关于AFLP收费价格

目前我们的基本价格是30个样，6~8对引物，6000元，实验周期大约为20天，如果您样品较多或引物组合较多，具体可协商。

3）条带数太多

PCR产物在ABI测序仪上电泳，检测系统的灵敏度要比银染高的多，数据分析是通过GENESCAN软件进行分析，所以对于很弱的带，如果人工统计的话，不会把这样的带统计进去，但软件分析的话，会读到这样的带。所以通过测序仪检测比银染条带数多，这个可以理解。另外我们一般通过控制荧光信号强度来控制条带数，对于扩增强以及扩增相对较弱的引物，通过控制荧光信号强度，尽量保证条带数在50~60条，最大限度减少由于扩增强度的问题，引起的条带数的差异，最真实的反映实验结果。

4）能否找到所有差异带的具体位置，并回收克隆差异条带？

请参照提供数据结果中，原始数据部分，数据表中，每个检测位点都有片段大小，有带的地方是片段的实际大小，无带的为0，很容易找到差异带。目前我们采取的荧光引物，跑测序胶，只能指出差异带的具体位置及片段大小，不能够回收克隆差异带。

5）共有谱带较少，多态性太高

   共有谱带为所有样品在某一位点扩增后共有的条带。因此只要有一个样品的扩增不好，或者在这个样品无扩增，就会导致共有普带数较少或没有。所以一定要保证实验材料新鲜，这样我们才能够保证后续试验中的PCR扩增没问题。如果样品确实有问题，为了不影响整体数据要去除这类样品。

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