细菌和真菌的DNA如何提取呢?
时间:2023-06-30 阅读:586
操作步骤:
1. 准备:无水乙醇、异丙醇、PBS 及 1.5mL 离心管。
2. 取出洗涤液,按终浓度 70%比例加入无水乙醇,如7.8mL 加入18.2mL 无水乙醇,充分混匀。
3. 菌体处理:将收集的细菌或真菌 5,000 rpm 离心3分钟,弃上清,加入 200μLPBS,振荡混匀,5,000 rpm 离心3分钟,充分弃上清。
4. 加入100 μL 裂解液Ⅰ,强烈 Vortex,直到沉淀至悬浮,无明显块状沉淀,再加入裂解酶 10μL,充分混匀,室温放置 20 分钟。
5. 加入200 μL 裂解液Ⅱ,20μL 复合消化液,充分混匀,65℃孵育 20 分钟。
6. 加入450μL 异丙醇,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响 DNA 的提取与后续实验。
7. 将吸附柱放入收集管内,将上述溶液全部转入吸附柱内,12,000 rpm 离心1分钟,弃收集管内废液。
8. 将吸附柱放回收集管内,加500μL 洗涤液至吸附柱内,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
9. 将吸附柱放回收集管内,加500μL 洗涤液至吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。同时,按每份样本 40μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 400μL 洗脱液),放置于灭菌 1.5mL 离心管,65℃预热。
10. 将吸附柱放回收集管内,12,000rpm 离心 2 分钟,离去残留的洗涤液。
11. 取出吸附柱,放入新的 1.5mL离心管内,加入上述预热的40μL 洗脱液,静置 2 分钟,12,000rpm离心 2 分钟,收集 DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。
注意事项:
1. 裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛,请立即用清水或生理盐水冲洗,必要时请就医。
2. 洗涤液最好现用现配,按需计算用量后配制。加入乙醇后的洗涤液如使用不完,2-8℃密封保存不超过 1 周。
3. 细菌量建议不高于 10^7 。
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