一、实验目的

酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应一般都在酶的作用下进行，没有酶的催化反应，植物生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。研究酶先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不同，有些工作只需粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。

二、实验原理

（1）酶的提取

1.酶存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。

2.酶如何从细胞中分离

  从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。此外，各种酶的存在状态不同，有外酶、内酶，内酶中有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时仅破碎细胞还不够，还需用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。如果没有特殊需要，一般选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。在提取过程中为了尽量减少酚类的影响，一般提取液常选用高pH值的缓冲溶液，在高pH值时，酚类大部游离而不与蛋白质形成强的氢键，但高pH值促进酚类氧化，同时降低酚类吸附剂（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。PVP能与游离酚羟基形成强的氢键复合物，是酚类化合物的有效结合剂。在提取线粒体时加入可溶性PVP，提取可溶性酶时加入不溶性交联PVP，能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金属元素及PVP单体，可加10% HCl煮沸10分钟，用NaOH中和，再用水洗几次，直至中性，纯化后的PVPP可直接应用。

植物细胞有坚韧的细胞壁，需要强烈的方法去破碎，少量样品可用研钵加石英砂研磨，或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷，提取液的用量一般为组织的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大。提取匀浆时加入酚类结合剂PVPP，金属螯合剂Na2─EDTA，以及─SH化合物以保护蛋白质，或加入非离子型去垢剂如Triton X─100，以增加蛋白质的可溶度，常用于与膜脂结合的酶。（可以通过试验以确定提取蛋白质的最佳条件。）

（2）离和纯化

1.上面制备得到的提取液中，除含有所需要的酶外，还含有其他蛋白质，以及其他大分子和小分子化合物杂质。

2.如何将酶从粗提液中分离纯化

要在许多蛋白质的混合物中分离出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有盐析法，往层析法，薄膜超滤法，亲和层析法，电泳法等。在大体积的提取液中一般先采用硫酸铵分级盐析沉淀。盐析法是提纯酶使用最早的方法之一，在高浓度的盐溶液中酶蛋白不易变性而失去活性，利于工作在室温中进行。不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低，盐析法就是利用这一性质，将不同性质的蛋白质分离，选择合适饱和度的硫酸铵，使沉淀的蛋白质酶活性最大。沉淀的蛋白质经离心后收集，再溶于少量缓冲溶液中，经透析或凝胶柱过滤，以除去硫酸铵及其他小分子杂质，再经过柱层析分离。由于吸附剂的不同，又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不同的支持物采用的洗脱方法也不同，分子筛类型凝胶过滤柱层析，洗脱液只要用一定浓度的缓冲液就可以了。对于吸附柱和离子交换柱层析，往往要采用浓度梯度溶液进行洗脱，最-方便的是线性梯度浓度，当然用非线性梯度会得到更好的分离效果。目前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样，已成为常规酶的分离提纯步骤之一。

  近年来纯化酶常用的一种有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶具有一定的结合能力，这一性质即可用来分离、提纯酶。先选择支持物，如琼脂糖将底物、竞争性抑制剂或辅酶，以共价键的形式连接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流过装有专一性底物、竞争抑制剂或辅酶的层析柱，酶即被保留在支持物上，再充分洗涤除去未被吸附的杂质，然后用含有一定浓度的底物或竞争性抑制剂或辅酶的缓冲液，进行竞争性洗脱。（亲和剂选择合适，能得到较高纯度的酶，是酶分离、纯化中既方便又有效的一种方法。）

（3）酶活力的测定

酶的活力表现为催化某一反应的速度，反应速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反应速度可以用单位时间内底物的消耗量或产物的积累量来表示。由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切，环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响，因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定。

酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分钟所分解的底物量（或生成的产物量）μmol数表示。测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同选用不同的方法，应用最-广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶；或反应产生H2O2，如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定。测定酶活性的方法很多，应根据具体情况选择合适的方法。