很多人第一次做ELISA实验，觉得真简单，无非就是加样，保温，洗涤等操作步骤。可是第二次做ELISA实验，实验结果怎么差那么多？同一份样本怎么可能呢？第三次做ELISA，决定认真一些，实验结果还是不尽人意，诶，也太难了！今天小编就给大家总结一下ELISA实验要点，掌握这些，实验So easy！

ELISA实验操作注意要点

一、加样

在 ELISA 中除了包被外，一般需进行 4－5 次加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。

1. 吸取样品时，加样枪吸头不应黏附多余的液体；加样时不可90度向孔中滴加液体，这样会导致液体残留在吸头上，加样不准确！

2. 不要将吸头伸入孔中，一方面若接触孔底可能压弯吸头，另一方面可能会将孔中的液体吹起来，加样不准确！

3.正确的加样方法应为45度，吸头贴着孔壁加入，应注意：

①角度太小，会使液体残留在孔壁上，导致加样不准确！

②吸头应当贴着管壁和液面的交界处！

二、保温

在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育。

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

在 ELISA 中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各 ELISA 板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于 20℃，ELISA 板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。

三、洗涤

洗涤在 ELISA 过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在 ELISA 测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合月桂酸的为聚山梨酯 20，在 ELISA 中为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。

洗涤如不*，特别在后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性 IgG 吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。

ELISA 板的洗涤一般可采用以下方法：

①吸干孔内反应液；

②将洗涤液注满板孔；

③放置 2 min，略作摇动；

④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为 3～4 次，有时甚至需洗 5～6 次。