免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展zui早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。

主要缺点是：非特异性染色问题尚未完quan解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

一、原理

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。

二、技术分类：

1.荧光抗体技术（荧光显微镜技术）

抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。

2.免疫荧光测定技术：

抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。

1）荧光物质

荧光色素

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。

常用的荧光色素：

（1）异硫氰酸荧光素为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，zui大吸收光波长为490495nm，zui大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都geng好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用zui广泛的荧光素。

其主要优点是：

①人眼对黄绿色较为敏感

②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

（2）四乙基罗丹明为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙-酮。性质稳定，可长期保存。zui大吸收光波长为570nm，zui大发射光波长为595-600nm，呈橘红色荧光。

（3）四甲基异硫氰酸罗丹明，zui大吸引光波长为550nm，zui大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。

常见荧光素的特性：

1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490～495nm，发射光：520～530nm，明亮的黄绿色荧光。

2）RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595～600nm，橘红色荧光。

3）TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。

4）镧系：Eu3+、Tb3+

5）PE：吸收光490～560nm，发射光 595nm，红色荧光。

6）其它：酶作用后产生荧光物质。