免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
一．传统的免疫荧光实验步骤
（一）、实验材料 
1. 细胞样品 
2. 试剂、试剂盒： 多聚甲Quan；70% 甲醇；丙Tong；PBS；Triton ；BSA；DAPI 染液；DABCO；Tris；甘油   
3. 仪器、耗材：玻片     

（二）、实验步骤     
细胞爬片免疫荧光实验步骤 
天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min；

2. 用 4% 的多聚甲Quan固定爬片 15 min， PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS 配制 ) 室温通透 20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

4. PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30 min；

5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃ 孵育过夜；

第二天：

6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 20-37℃ 孵育 1 h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3 min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加 DAPI 避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4 次洗去多余的 DAPI；

8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像

二 传统免疫荧光实验主要问题

1. 爬片效果欠佳
2. 细胞和试剂用量大，成本高
3. 染液分布不均
4. 操作繁琐,费时费力

三. 一体化免疫荧光技术简介 
一体化的培养室-固定-染色-成像 免疫荧光的解决方案

技术特点：
1.快速简便的样品制备,一体化培养室简化了免疫荧光染色方案
2.均匀细胞分布,通道载玻片几何结构可以产生均匀的细胞分布
3.经济实惠的实验方案，需要少量的细胞和试剂
4.高分辨率成像，适用于宽场荧光，共焦成像，FRAP-FRET-FLIM和高质量的相差成像（Phase Contrast）
 
主要工作模式：
1. 通道模式：ibidi通道载玻片是使用少量试剂的理想选择。μ-Slides VI0.4是一般免疫荧光检测的理想选择，而μ-Slide I0.4Luer可在低密度培养和流动实验中进行免疫荧光染色。

2.开放腔室模式
Ibidi μ-Slide 8 孔和μ-Dish35mm 能够在全内腔中实现标准免疫荧光方案，无盖玻片。染色后，使用高分辨率显微镜通过聚合物盖玻片底部观察样品。

3. 可拆卸腔室载玻片模式
带有腔室的可拆卸硅垫片为个体细胞培养和孵育提供了理想的模式。ibidi micro-Insert 4 Well可以使用极低的试剂量。可拆卸3Well|8Well|12 Well Chambers是长期样品储存的理想选择。

1. 一体化免疫荧光技术应用举例

*过800篇参考文献证明了使用ibidi产品进行免疫荧光检测的优势。

1. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured under flow conditions in μ-Slide I ^0.4 Luer

蓝色: nucleus (DAPI)
绿色: VE-cadherins (Alexa 488 conjugated antibody)
红色: actin cytoskeleton (Cy5 conjugated antibody)

2. Cell line Madin-Darby canine kidney (MDCK) cultured in μ-Slide VI ^0.4

蓝色: nucleus (DAPI)
绿色: actin cytoskeleton (Alexa 488 conjugated antibody)
红色: mitochondria (MitoTracker)

3. Differentiated mouse fibroblasts cultured on elastic surface (ESS 28 kPa)

绿色: zyxin (Alexa 488 conjugated antibody)
红色: alpha-smooth muscle actin (Cy5 conjugated antibody)

产品技术参数表

五. 总结和评价
（1）这种腔式载玻片／培养皿，不需要包被，不需要爬片，培养细胞－冲洗玻片－固定细胞－染色－成像，所有步骤都在这个  载玻片就可以完成，直接镜检成像效果良好；
（2）如果希望做完实验还可以封片保存的，有这种可移除的腔式载玻片，3孔8孔12孔，根据实验需要选择，种好细胞染色之后，就可以撕掉框架，直接观察或者封片保存；
 （3）如果实验希望做小容量的，这种通道载玻片，跟普通免疫荧光实验对比，用枪加液和吸液就可以完成所有免疫荧光步骤，操作更简单；节省细胞节省试剂，一个通道只需要25微升液体；保证细胞分布均匀，得到更好的观察结果；
（4）如果实验需要做大容量的，或者做长时间的活细胞观察的，IBIDI培养皿，底部比普通载玻片的成像效果要好，可以直接完成所有细胞操作和观察，这个有配套的盖子可以减少污染，杜绝蒸发，盖子可锁可不锁，锁上的话，蒸发率基本为零，适合长时间观察细胞；
（5）如果实验需要定期观察同一个细胞／重新找回某一个之前观察过的细胞，或计数细胞，有带计数格的培养皿和腔式载玻片（8孔的），只要记住细胞的坐标，每次都可以轻松找回同一个细胞，不像平常用记号笔标记的那么不准确，记号笔的痕迹还会影响观察；
（6）如果实验要做高通量的免疫荧光，比如药筛，有24孔板，96孔板，384孔，价格和市面的多孔板差不多，多孔板不需要包被，也不会有自发荧光，孔壁是黑色的，所以孔和孔之间的免疫荧光不会互相影响；
（7）这些耗材专门为共聚焦*分辨显微成像设计，效果很好；
（8）这些产品都是通过ibidi的物理方法ibiditreat处理，底部都是*薄亲水的，大多数种类细胞都可以直接贴壁生长的，不需要另外包被了；如果有特殊实验需求，可以自己再包被的（选择uncoated版本）；