实时荧光定量PCR工作原理
时间：2021-01-08 阅读：3542
实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）
基本原理
qPCR 技术是在反应体系中加入荧光报告基团和荧光淬灭基团，随着 PCR 反应的进行，扩增产物不断积累，导致荧光信号不断积累， 从而利用荧光信号的变化实时监测整个 PCR 进程。
根据 PCR 定量原理公式可推导出， 模板起始拷贝数的对数与阈值循环数呈线性关系，模板起始拷贝数越多，荧光信号达到阈值的循环数越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品绘制标准曲线，根据荧光基团发出的荧光强度与 PCR 扩增产物的数量呈对应关系， 只要对荧光信号进行实时监测并得到未知样品的 Ct 值，即可通过标准曲线计算未知样品的起始拷贝数。
Ct 值指 PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。相同模板进行 96 次扩增，终点处产物量不恒定，但 Ct 值却重现性。
模板 DNA 量越多，荧光达到域值的循环数越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板浓度与 Ct 呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品 Ct 值，就可以计算出样品中所含的模板量。
目前常用荧光标记方法
方法 | 优点 | 缺点 | 应用范围 |
SYBR Green I | 适用性广 灵敏 方便 便宜 | 引物要求高 易出现非特异条带 | 科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物研究 |
Taqman | 特异性高 重复性好 | 价格高 只适合特定目标 | 病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病诊断 |
分子信标 | 高特异性 荧光背景低 | 只适合特定目标 设计困难 价格高 | 特定基因分析，SNP分析 |
荧光定量 PCR 反应体系举例 | |
试剂 | 含量 |
2xGoTaq Master Mix | 5µl |
无核酸酶水 | 3.5µl |
上游引物 | 0.25µl |
下游引物 | 0.25µl |
基因组 DNA | 1µl（约20ng）梯度稀释 |
共 10µl | |
仪器与耗材
在普通 PCR 仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量 PCR 仪。其 PCR 扩增原理和普通 PCR 仪扩增原理相同，只是 PCR 扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出，把这 PCR 仪叫做实时荧光定量 PCR 仪 (qPCR 仪)。荧光定量 PCR 仪有单通道，双通道，和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道，有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测，生物医药研发，食品行业，科研院校等机构。