在做qPCR实验时，我们经常会问：“你是做定量还是相对定量呢？”，而定量方法的选择是取决于实验的目标。定量可测定目标核酸分子的实际拷贝数，但也是费力、复杂的定量形式。此方法要求周密的实验方案和高度准确的标准曲线，常用于确定病毒滴度。

使用标准曲线进行定量

定量是通过样品的Cq值和标准曲线进行比较实现的。首先为了建立标准曲线，需要已知拷贝数浓度的标准品，对标准品进行5次以上的连续梯度稀释，将稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增，后根据各样品的拷贝数浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，其中X0为起始模板量。然后将未知样本的Cq值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数浓度。

从图1可以发现，当模板起始浓度越大时，荧光达到阈值的循环数越少，即Cq值越小。反之，模板起始浓度越小时，Cq值越大。起始模板量的Log值与循环数Cq值呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，即可确定未知待测样本中目的基因的量。

如何选择标准品？

如前所述，生成标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。所以使用与实验样本尽可能类似的目标模板，可优选有证的标准物质或参考物质。那么制备标准品的常见方法如下：

☑  DNA 标准品：目的靶点的PCR扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆（图2）。

优点：易于生成、定量，可在适当的储存条件下维持稳定性。

缺点：无法进行qRT-PCR 的逆转录步骤，大大影响了反应效率。

PCR扩增片段：通过常规PCR进行目的片段扩增，回收纯化PCR扩增片段，可直接作为标准品，相对于质粒，PCR扩增片段不是那么稳定。

质粒克隆：将目的片段进行PCR扩增，回收目的条带后连入T载体，再进行质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用。

☑  RNA 标准品：目的靶点的体外转录RNA(图3)

优点：结合了RT效率，程度地模拟了目的靶点。

缺点：需要耗费时间生成该标准品，因其不稳定，难以保持长期准确度。

体外转录RNA：利用实时荧光定量PCR生成的PCR 产物可利用包含5’ T7启动子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆转录引物重新扩增。体外转录反应生成多聚腺苷酸化正义mRNA。纯化后可将其准确定量并稀释，用于生成标准曲线。

Azure  Cielo™实时荧光定量PCR系统——定量示例

•方法:从组织中提取基因组DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测

•试剂:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)