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上海巴玖为您讲解PCR实验的准备工作及步骤

时间:2021-01-11      阅读:1392

步骤构成:

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在酶的作用下,以P为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
  重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
 
实验试剂与器材:

模板DNA、2.5mmol/L   q DNA聚合酶(5U/SSR引物
10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O
PCR仪、移液枪、PCR板

实验步骤:
  
一、实验器具与材料:
  1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
  2、吸头:1ml、200μl、20μl
  3、匀浆管:5ml
  4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个
  5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl
  6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)
  1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)
  7、量筒:50ml、250ml、500ml
  8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml
  9、试管架:5ml、1.5ml、20μl
  10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水
  11、铝制饭盒:4个
  12、塑料小饭盒:1个
  13、大瓷缸:2个
  14、锡泊纸:一卷
  15、卷纸:2卷
  16、三角烧瓶:带盖,稍大

实验器具的处理与准备:
  
1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)
  先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)
2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)
3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)

试剂配制:
1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)
3、异丙醇:放入棕色瓶中
4:放入棕色瓶中
5、琼脂糖
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