常用蛋白质浓度测定方法汇总

 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础。目前常用的蛋白测量的方法主要有BCA法、考马斯亮蓝法(Bradford)和Lowry法等。

  BCA法  

 原理

 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+(biuret reaction)。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

实验步骤

1.按试剂盒说明书配置BCA工作液；

2.完溶解蛋白质标准品，加到96孔板的蛋白标准品孔中，按照说明书要求对标品进行梯度稀释，加入BCA工作液，用酶标仪测定其吸光度；

3.以样品浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线；

4.待测样品中加入BCA工作液，测定吸光度，带入标准曲线中，计算样品浓度。

  与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

  考马斯亮蓝法(Bradford)法  

 原理

 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

实验步骤

1.按试剂盒说明书配置Bradford染液；

2.全溶解蛋白质标准品，加到96孔板的蛋白标准品孔中，按照说明书要求对标品进行梯度稀释，加入染液和染料结合液后，用酶标仪测定其吸光度；

3.以标品浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线；

4.各孔中加入染液和染料结合液，测定样品吸光度，带入标准曲线中，计算样品浓度。

 Bradford法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质。

   斐林—酚试剂(Lowry)法   

 原理

 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关，在650nm波长下有最大光吸收。

 实验步骤

 与上述两种方法大致相同

 LORRY法灵敏度高,重复性好，适于5～l00μg蛋白质的定量，耗时长，操作要严格计时，在实验中要特别注意排除还原物质、柠檬酸等的干扰作用才能得到最准确的实验结果。

 这几种方法共同点在于，都需要绘制标准曲线，而标准曲线及待测样品往往数量较多，为了缩短实验耗时，保证测量准确性，可使用酶标仪对吸光度进行测定。