摘要
定量聚合酶链反应（qPCR）分析具有高灵敏度，这是其成功并广泛应用于科学实验室的最重要原因之一。然而，包括移液技术在内的许多因素都会对qPCR分析的结果产生影响。PCR Master Mix 通常在qPCR准备期间使用，但可能很难对其进行准确移液。在本研究中，我们测试了在qPCR中使用电动移液器移取Master Mix。研究证明，使用电动移液器搭配低吸附滤芯吸头或标准滤芯吸头对Master Mix移液，可获得良好的精准性，并能确保移液速度及结果的重现性。从而得出结论，在进行基于PCR的分析时，使用电动移液器移取Master Mix确保得到可重复且可靠的结果。
 
 
引言
基于PCR的应用已成为生物制药工艺、临床诊断和学术研究的关键手段。然而，在执行定量聚合酶链反应（qPCR）时，实验结果的可变性可能是个问题，移液误差是需要重点关注的变化来源之一。在qPCR准备阶段，对Master Mix试剂进行移液具有挑战性。Master Mix通常由聚合酶、dNTP、MgCl2以及可能含吐温和甘油成分的缓冲液组成。

本应用说明的目的是测试在PCR分析应用中使用电动移液器移取Master Mix的可靠性。在定量PCR准备阶段，使用电动移液器搭配低吸附滤芯吸头来移取Master Mix，实验结果（定量循环，Cq）由准确度和精准度（重现性）来进行评价。

 
方法

移液器和移液器吸头选择
使用Picus®电动移液器、Safetyspace低吸附滤芯吸头和滤芯吸头。Picus®使用多次分液模式。移取Master Mix时，将电动移液器速度参数设置为1。

qPCR准备
qPCR准备阶段使用Picus®电动移液器、Safetyspace滤芯吸头及低吸附滤芯吸头。Lo-Bind EP管用于DNA样品制备及Master Mix的制备。制备用于所有测试的PCR Master Mix储备液使用了MaximaSYBR Green qPCR Master Mix（不含ROX）、大肠杆菌uidA基因引物以及无核酸酶水。

用移液器将八个 15μL 的Master Mix重复样品移取至PCR板孔中，用于各种测试条件。无模板对照（NTC）样品不含大肠杆菌基因组DNA，并加入 5μL 无核酸酶水。用类似方法移取 5μL 含有1×106、1×105、1×104、1×103 以及1×102 个拷贝丨反应大肠杆菌gDNA的系列稀释标准品。

在每个测试孔中有 5μL 含有1×103 个拷贝丨反应的大肠杆菌gDNA。使用Picus® 电动移液器的多次分液功能及低吸附滤芯吸头以相同的方式将所有DNA样本添加到PCR管中。使用LightCycler®480 qPCR仪进行qPCR。循环参数如下：在 95°C下预培养 10 分钟，随后在 95°C 10 秒、55°C 10 秒、75°C 15 秒，75°C延伸 10 秒，40 次循环。

对标准品、对照品和样品中的SYBR绿色荧光激发进行定量。使用LightCycler® 480软件确定定量循环（Cq）值和实际拷贝数，并使用MS Excel分析结果。

数据分析
Cq值的百分比系统误差（%S）反映了处理Master Mix的仪器系统（移液器和吸头系统）Cq值的误差。移液过程中的随机误差是结果精准度的测量，反映了实验中重复样品之间的差异。Cq值的百分比随机误差（%R）反映了结果的重现性，并且可能受到实验人员移液操作的影响。