以DIG 标定核酸探针
时间：2012-07-16 阅读：1317
DNA探针一般可以用32P, 35S或非放射性物质如biotin及digoxigenin （DIG） 加以标定；标定时利用DNA聚合酶的活性，在DNA聚合反应中，另加入 [α-32P] dATP,[α-32P] dCTP或DIG-11-dUTP等标定物质，所合成出來的即是被标定的核酸片段。目前常見的方法包括nick translation, random priming与polymerase chain reaction（PCR） 等。 若须对DNA进行end labeling时，可以进行kinase或filling-in reaction。
前者以 [γ-32P] ATP为phosphate donor，利用T4 polynucleotide kinase的活性对带有5’-OH的DNA进行标定。人工合成的寡核苷酸 （oligonucleotides） 5’端为-OH group，可直接用于kinase reaction；一般DNA片段，若5’端带有phosphate group，先经phosphatase处理，再进行kinase reaction。 Filling-in reaction是将DNA以特定限制酶切开，露出recessed 3’ termini后，利用Klenow的活性把3’端补齐 （filling-in）；因此，只要加入适当的 [α-32P] dNTP，即可在DNA的3’端进行标定。
此外，也可以应用bacteriophage T4 DNA polymerase 的3’→5’ exonuclease 活性制造recessed 3’termini，再进行filling-in。 至于正意股或反意股RNA探针，则可以 [α-32P] UTP或DIG-11-UTP等为标定物质，应用胞外转录反应加以标定。 下面要介绍的是目前zui常用的方法：random priming及PCR。