对于禽流感传统的病原学诊断方法是用鸡胚或者狗肾细胞（MDCK）、鸡胚成纤维细胞（CEF）等进行病毒分离，采用血凝和血凝抑制进行鉴定，血清学的诊断方法则包括中和试验和琼脂扩散试验等。近年来，随着免疫学和分子生物学技术的飞速发展，禽流感的诊断技术也越来越完善，现在已经有免疫印迹、免疫荧光、ELISA、墓因芯片、RT-PCR技术、荧光RT-PCR技术、NASBA技术等。

如果要检验是否是高致病性禽流感病毒，在进行HA亚型鉴定之后，还需要进行细胞培养、动物试验或进行裂解位点的序列分析等进行判断。因为OIE判断HPAIV的标准是：①含流感病毒尿囊液，做l：10稀释，静脉内接种8只4～8周龄易感鸡，每只0．2ml，如在10天内死亡6只以上，则该流感病毒为HPAIV~②如果致死l一5只易感鸡，而且又不是H5或H7亚型，则将其接种鸡胚成纤维细胞（CEF）或MDCK细胞，在没有胰酶的情况下观察是否产生细胞病理变化，如不产生病理变化，该流感病毒就不是HPAIV；③对于所有的低致病性H5和H7亚型病毒和其他流感病毒，如果在没有胰酶的条件下在细胞培养能生长，则必须测定血凝素裂解部位的氨基酸顺序，如果相似于其他的HPAIV，存在多个碱性氨基酸序列，则该受检病毒被视为高致病性。

 

    1．样品采集

    样品采集的质量是进行禽流感检测的关键。应从死禽和处于急性发病期的病禽采集样品，样品要具有典型性。采样过程要注意无菌操作，同时避免污染环境。采样人员要按NY／丁7（38要求加强个人防护。样品的保存和运输也要按照有关的规定和要求进行。

    （1）病料样品  至少从5只病禽和病死禽中采集病料样品（发病群不足5只则全部采样）。样品应包括：泄殖腔（新鲜粪尿样）棉拭子和气管棉拭子（置于缓冲液中）；气管和肺的混样；肠管及内容物的混样；肝、脾、肾和脑等其他组织样品（不能混样）。

    组织样品、气管棉拭子单独放人容器，容器中盛放含有抗生素（pH值为7．0～7．4）的PBS液。抗生素的选择应视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中加入青霉素（20001U／ml）、链霉素（2mg／ml）或庆大霉素（50t~g／m1）。肠管及内容物、粪便样品和泄殖腔棉拭子所用的抗生素浓度应提高5倍（加入抗生素后PBS液的pH值应调至7．0-7．4）。

（2）血样  分别采集至少10个病禽的（急性发病期血清，如发病群不足10只则全部采样），并要求单独存放，不能混合。

 

    2．病毒的分离鉴定

    以无菌拭子采集气管或泄殖腔病料或病变组织，研磨制成10％悬液，经处理后接种9-11日龄SPF鸡胚，收获尿囊液测定血凝活性，若为阴性则应继续盲传2～3代。对具有血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清做HI试验，以排除新城疫的可能，即使ND阳性也应采用中和法继续传代，看是否为ND与AIV混合感染。然后用免疫扩散等方法来检测特异性核心抗原NP或MP，然后用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。分离鉴定的同时，进行致病力试验，确定毒力的强弱。

    鸡胚培养法的优点  鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒；鸡胚是个整体，有神经血管的分布及脏器的构造；来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。3天可报告结果。病毒分离鉴定对AI的诊断比较确实，但操作程序繁杂，费用高，耗时费力。