L-异亮氨酸甲酯盐酸盐说明书,L-异亮氨酸甲酯盐酸盐资料
时间:2013-03-14 阅读:519
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519次1.为了洗脱细菌,将BL21或BLT5615过夜培养的菌液用M9LB稀释到在600nm处OD值为1。如果使用BLT5615菌株与T7Selectl—1或T7Selectl0—3载体,就必须向菌液中加入IPTG,使其终浓度为10umol/L。
2.将900/21该菌液加到裂解后的细胞中,于室温下孵育10分钟。
3.为了测定T7噬菌体的产出量,从步骤2的试管中分别取1ul 1:10稀释液、1ul原液和10ul原液铺板,每种铺3个:分别取1ul 1:10稀释液、1ul原液和10ul原液加入14ml 聚苯乙烯管中, 同时还加入300rrl的BL21或BLT5615(含IPTG) 菌液,并与4ml熔化的(45~50℃)上层琼脂混合。将含有噬菌体和细菌的上层琼脂倒于LB琼脂(BL21)平板上,或是倒在含50gg/ml羧苄青霉素的LB琼脂(BLT5615)平板上。将平板置于37℃孵育1,5~3小时,或室温下孵育过夜。
4.为了测定每份器官或组织的噬菌体总的产出量,将每个平板上的噬菌斑(pfu)数目除以铺板体积(0.1ul、1ul或10ul),然后再乘以1000ul。这样计算的原因是每份细胞沉淀中添加了1000gl菌液。例如:在脑组织的1ul培养基平板中平均有200pfu的噬菌体,那么在脑组织中噬菌体总产出量为2.0×105pfu/g。对每份器官和组织中的3个平板的计数取平均值,对数据作图。
5.为了扩增及纯化回收的T7噬菌体,将步骤2所剩的噬菌体加到10ml在600nm处OD值为0.5的BL21或BLT5615(加有10mmol/L的IPTG) 菌液中。于37℃摇瓶培养2小时,直到菌液被裂解并变澄清。
6.将菌液倒入30ml的Oak Ridge离心管中,并在Sorvall SS—34或同等的转子中, 以8000r/min(7670g)离心10分钟。通过带0,2um滤头的注射器将每份上清分别过滤到50m1无菌锥形瓶中,并保存于4℃。T7培养物上清典型的滴定量为107pfu/ul。我们采用T7溶菌液直接进行下面的实验,而没有用沉淀法进行进一步的纯化。