限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法
时间：2012-05-25 阅读：14086
酶切出现问题，先看内切酶说明书，相应试剂公司目录。不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，酶切效果也有差别。可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活性可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶等等。
1. 酶切不开或不*
1.1 质粒问题：纯度差或残留酶切抑制物zui为常见。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等。[重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂]
1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。确认酶切效果不好，做标记，更换] 。
【题外话：用内切酶注意】
a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。
b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。
c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。此外，有时由于操作不小心，冰盒上凝结的一些碎冰掉在酶管里了（我自己出现过两次，汗....）
d. 吸取酶时的tips。我们常用来取酶的tips都是zui小的那种，适合2ul和10ul的枪，但tips通常有两种，一种是zui常用的短的tips，用它取酶时，tips挨着酶液后，枪几乎是要插入管子，有时会在枪身上沾上酶液。因此，可能会产生污染。那么我们必要非常注意动作，要么就换用另一种长的 tips，专门取酶液用。
1.3 buffer问题。有些酶切的buffer中，添加了一些较为容易析出或溶解的成分[连接酶的buffer更是这样]，有时酶切的buffer没有*融化时，buffer的浓度是不均一的。新的buffer先融化的部分，盐离子浓度要高，使用一段时间后，融化部分的离子浓度会变低。通常，这种影响不大，但如果是使用一些对离子浓度敏感的内切酶时就会出现问题。
1.4 双酶切的buffer选择：确认使用的是正确的buffer和反应温度[具体可以参考各厂家提供的酶切buffer以及双酶切buffer的资料，其中，NEB的可以参见
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm
1.5 酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有Xba I、Bcl I 等。甲基化主要分为Dam、Dcm和CpG甲基化等。如果是提取的质粒，质粒就会因大肠杆菌的Dam、Dcm被甲基化；如果是直接从哺乳动物细胞中提取的DNA，则部分DNA就会因CG methylase的影响而被甲基化。一些酶切位点被甲基化后，酶切会受影响。因此，出现酶切不开或不全时需要考虑甲基化的问题。甲基化通常出现在特定序列，以Xba I为例，仅当序列位5'-【TCTAGA】TC-3'时，Xba I的位点才会被甲基化，并非所有的Xba I位点都会出现甲基化。
具体的列表可以参考
http://www.biocolors.com.cn/en/gsxw_p.asp?N_id=12
http://bio.takara.co.jp/BIO_EN/catalog_d.asp?C_ID=C0007
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/alteration.htm
其中，克隆常用的酶切位点见下表：
Restriction Enzyme Methylation
Sequence &Site Methylation Type Enzyme Activity Blocked?
AarI 5'...CACCTG cG...3' C partially
ApaI 5'...GGGCC cG...3' C partially
ApaI 5'...GGGCCc WGG...3' D partially
BclI 5-TGaTCA...3' A Compley
BglI 5'...GCC（N）5GG cG...3' C partially
BglI 5'...GCc WGGNNGGC...3' D Compley
Esp3I 5'...CGTCTC...3' E Compley
HincII 5'...GTYRA cG...3' C partially
HinfI 5'...GANT cG...3' C partially
HpaII 5'...CCGG...3' E Compley
HphI 5'...GGTGa TC...3' B Compley
MboI 5'...GaTC...3' A Compley
NheI 5'...GCTAG cG...3' C partially
NmuCI 5'...GTCA cG...3' C partially
NotI 5'...GCGGCCGC...3' E Compley
PvuI 5'...CGATCG...3' E Compley
RsaI 5'...GTA cG...3' C partially
SalI 5'...GTCGAC...3' E Compley
SatI 5'...G cG GC...3' C Compley
SmaI 5'...CCCGGG...3' E Compley
XbaI 5'...TCTAGa TC...3' B Compley
XhoI 5'...CTCGAG...3' E partially
Type A: a - N6-methyladenine （m6A）
Type B: a - N6-methyladenine （m6A）, Partially Overlap Dam Methylase Site GATC
Type C: c - 5-methylcytosine （m5C），Overlap CG
Type D: c - 5-methylcytosine （m5C） ，Partially Overlap Dcm Methylase Site CCWGG
Type E: m5CG or m5CNG（这种修饰主要发生在植物和动物来源的DNA）
1.6 酶切体系问题：通常较大的反应体系（>=50ul），较少量的质粒（<=1ug,或更少），酶切的会更加*一些。
1.7 酶切或双酶切时，保护性碱基及近末端位点碱基个数的问题。在酶切PCR产物时，酶切位点旁的碱基个数可能会影响酶切效率。同样，在双酶切载体时，如果两个载体相邻过近，也有可能会影响酶切效果。这个问题以前也曾有讨论，具体可以参考
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8577107&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#8577107
关于相关的资料可以参见：
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm [针对PCR产物酶切位点保护性碱基的资料]
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_vector.htm [针对载体酶切位点近末端位点碱基个数对酶切影响的资料]
2. 质粒酶切时出现smear。
2.1 体系中的内切酶含量过高：通常酶切体系中的内切酶含量不宜超过酶切体系的10％，不管是单一酶切还是双酶切，酶的含量在5％以下是比较合适的。由于酶是保存在50％甘油缓冲液中，过高的酶用量会导致甘油含量提高，而从引起酶的星活性；
2.2 酶切反应过程中有导致星活性的因素：有些内切酶除了对甘油浓度外，对离子浓度、反应温度、酶含量、反应时间等都可能产生星活性。所以在使用内切酶时，一定要留意说明书中的描述，避免可能出现星活性情况的发生。减少酶用量、合适的反应温度、不进行长时间的酶切反应，可减少星活性的出现。
2.3 酶切体系可能污染了其它物质：如其它的DNA、其它的内切酶或DNA酶等。
参考贴：
限制性内切酶的热失活：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893410&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893410
内切酶星号活性：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893487&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893487
限制性内切酶保护碱基：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893511&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893511
进37度之前，用vortex或移液枪混一下更好，能把壁上的液体旋掉!
热失活是终止酶切反应的一种简便易行的方法。大多数zui适反应温度是37℃的酶在65℃下温育20分钟即可失活。一些在65℃下不能失活的酶如将温度升高至80℃，温育20分钟也可失活。下表注明了每种酶的失活条件。
在50μl的反应体系中，37℃条件下，以0.5μg小牛胸腺DNA作为底物，加入5-10μl内切酶及相应缓冲液，反应60分钟，然后升温至65℃或 80℃温育20分钟进行热失活。在上述混合液中加入0.5μg底物DNA（通常为λDNA），调节温度至zui适反应温度，温育60分钟。若琼脂糖电泳显示底物部分或*被消化，则表明该酶没有*被热失活。
内切酶星号活性
在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不*相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性（1），如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。NEB已证实下列酶存在星号活性：Apo I（2）、Ase I（2）、BamH I（3）、BssH II（2）、EcoR I（4）、EcoR V（5）、Hind III（1）、Hinf I（6、7）、Pst I（8）、Pvu II（9）、Sal I（8）、Sca I（2）、Taq I（10）、Xmn I（2）。
酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有：单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻（10）。Polisky等（4）对EcoR I的早期研究表明，在低盐浓度、高pH值条件下，EcoR I可能切割N/AATTN序列；zui近，Gardner等（11）的研究表明，只要识别中心的四碱基序列（AATT）不出现A/T替换，EcoR I可以切割其它任何单碱基替代序列。
大多数星号活性是可以控制的，做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提供的NEBuffer，NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。
导致星号活性的因素：
1. 较高的甘油浓度（>5% v/v）；
2. 酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为>100 U/µg）；
3. 低盐浓度（<25 mM）
4. 高pH值（>pH 8.0）
5. 存在有机溶剂（如DMSO、乙醇（9）、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane（12）等）
6. 用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）
以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些（2）。
1. 尽量用较少的酶进行*消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。
2. 尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。
3. 将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。
限制性内切酶保护碱基（不太懂）:
限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。保护碱基常见于PCR引物设计时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，使酶切*而添加。其次，在分子克隆时，选择载体的酶切位点也会碰到，相临的2个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
保护碱基的具体设计可以可以看图:
我有点不明白，上图是检测内切酶在切割不同寡核苷酸时的效率数据，怎么能作为保护碱基的设计用呢？我设计引物是随机设计保护碱基也切得很好呀？望楼主及战友们赐教
的确，上图是检测内切酶在切割不同寡核苷酸时的效率数据，数据不仅考虑到末端碱基数量的影响，同时还考虑到了末端碱基组成对酶切效率的影响，*存在推敲的是，这些数据是使用“寡核苷酸”进行实验的数据。
也就是说，保护性碱基的设计，除了要考虑“碱基个数”外，“碱基组成”也是要考虑的。当然，我们大多数战友，包括我自己，考虑zui多的是“碱基个数”，对“碱基组成”的考虑通常是采用随机，或兼顾引物Tm及GC％上。
因此，只考虑“碱基个数”是比较省事的选择，且似乎还没有出现问题，至少我的实验还没有出现因为“碱基组成”不当而影响酶切的事情。
下表是引自TAKARA的，我个人觉得应该适合NEB、MBI、PROMEGA等其它的酶，它给出的结果仅考虑了“碱基个数”，对我们可能有帮助。
我做了一次酶切,虽然有目的条带（载体和目的基因,目的基因不是很明显,相反在其下方的条带更明显）,也就是说有杂带,请问这结果的肯能原因.
我的菌株是从其他老师那里得来的,提取出来的质粒好象比理想的要大（理想4000左右,跑出来的比5000大）.双酶切质粒载体很明显（pUC2700左右）,就是目的基因1400位置比较模糊（还是有）,900左右位置却更明显,而且下方还有杂带. 按道理不应该酶把目的基因切断. 请问可能的原因有哪些啊,怎么改进啊.谢谢了.
1. “理想4000左右,跑出来的比5000大” —— 质粒是否经过单酶切处理？如果只是简单的将质粒进行电泳，数据是不具有参考意义的。
2. “目的基因1400位置比较模糊（还是有）,900左右位置却更明显,而且下方还有杂带. 按道理不应该酶把目的基因切断.” —— 仔细分析一下酶切位点，确认除了外源片断两端外没有其它的内部切点。
附图，这样可以更好的讨论问题。
需要去掉质粒上eGFP后的中止子,用于融合表达,方法是:在eGFP片断的上下游分别设计引物做pcr后连接,上游加BamH1的酶切位点,下游加Bgl2的酶切位点（同质粒上的酶切位点,不能改）.
pcr没有问题,连接也有菌落长的很好,但是挑了40多个克隆,都是自连的,（我没有用碱性磷酸酶磷酸化质粒）.BamH1和Bgl2的粘性末端是一样的,但是pcr都没有,所以考虑是自连.
其他因素排除后,我觉得可能是引物合成出错导致pcr产物不能酶切,就又在另一个公司合成了引物,但是重新做的连接,挑了10个菌做pcr还是阴性.
我现在怀疑是不是引物设计的问题了,我在酶切位点前面加的保护性碱基会不会影响酶切的效率.请高手帮忙看一下我的引物,谢谢
上游: ATT GGATCC GGA TCT GCG ATC GCT CC
下游: ATA AGATCT ACT ACT GCT TCC GTA CAG CTC GTC CAT GC（由于融合表达,加了几个弱性aa）
限制性内切酶酶切注意事项
在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的
条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：
1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当zui终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活
性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。
3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。
4. 多种因素可引发星型反应：①非zui适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在（>12%）；⑥有机溶剂的存在。
5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。
6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一zui大的消化量指标可参考。
7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：
①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；
②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。
8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA存在位点的数目比较后，决定用酶量。对于超螺旋DNA，基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA，使用的酶单位活性应适当加大。
9. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。
10.酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、 yi mi，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。
11.DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。
12.要保证酶作用时的*反应条件（ph, 温度）和底物用量，酶反应才能有效地进行。
13.反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。
14.高于37℃或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。
15.反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。
16.反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
17.用已硅化的离心管进行酶切反应，可获得更佳的酶切效果，否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。
18.终止酶反应可根据需要采用不同的方法：①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应；②若需进一步反应（如连接，切割等），可将反应管置65℃保温20-30分钟，以灭活酶终止反应。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。
19. 不同厂家的试剂不可混用，需要时请查明相关条件及数据。
二、限制性酶解中常见的问题及解决措施：
限制性酶切割DNA底物的操作过程中，会出现一些问题，产生的原因主要为酶解体系中各要素处于非*状态，包括DNA的纯度和特性，反应缓冲液、反应体积、反应时间及温度等。
问题
原因
解决办法
DNA*没有被内切酶切割
1） 内切酶失活。用标准底物检测酶活性
2） DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子。将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3） 条件不适（试剂、温度）。检查反应系统是否*？
4） DNA酶切位点上的碱基被甲基化。换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株
5） DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）。换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I），重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增
6） DNA位点上存在其它修饰。将DNA底物与λDNA混匀进行切割验证
7） DNA不存在该酶识别顺序。换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证
DNA切割不*
1） 内切酶活性下降。用5-10倍量过量消化
2） 内切酶稀释不正确。用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
3） DNA不纯，反应条件不佳。同上
4） 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰。同上
5） 部分DNA溶液粘在管壁上。反应前离心数秒
6） 内切酶溶液粘度大，取样不准。将内切酶稀释，增大取样体积
7） 酶切后DNA粘末端退火。电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷
8） 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性。使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡
9） 过度稀释使酶活性降低。适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏
10）反应条件不适。使用*反应体系
11）识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序。加大酶量5-10倍
DNA PIAN段数目多于理伦值
1） 内切酶星状活性
检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均可导致星状活性，降低酶的用量
2） 其它内切酶污染
用λDNA作底物检查酶切结果
3） 底物中含其它DNA杂质
电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA pian段
酶切后没有观察到DNA pian段的存在
1） DNA定量错误（如RNA含量较高）
用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量
2） 在酶切反应液中形成非特异的沉淀
在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次
内切酶保存期内快速失活
1） 保存温度不合适
内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存
2） 以稀释形式保存
稀释酶液不宜长期存放，应一次使用
3） 贮藏缓冲液不适当
使用厂家推荐的贮藏缓冲液
4） 低蛋白浓度
内切酶与500ug/ml的BSA一起保存
电泳后DNA PIAN段的带型弥散，不均一
1） DNA上结合有蛋白质
电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/lv fang抽提纯化
2） 内切酶中含有DNA外切酶
减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
酶切后的DNA pian段连接效率低
1） 含磷酸盐的浓度高
透析，乙醇沉淀去除磷酸盐
2） 内切酶失活不全或含有ATP酶
延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
3） 平末端连接
加大T4 DNA Ligase用量
4） 外切酶污染
减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA
5） 连接缓冲液不合适
重新配制