PCR反应条件的控制：

1.  PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。 

2.  镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。

　　
3.  底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。

　
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。

　　
5.  引物浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。

　
6.  反应温度

（1）变性温度和时间95℃，30 s。

（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

二、PCR的循环参数
 
1.  预变性（Initial denaturation）

模板DNA变性与PCR酶的激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2.  循环中的变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不好，易造成扩增失败。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略

延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

5.  循环数

大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

6.  最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸，并使单链产物退火成双链。