酶联免疫吸附分析Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA是以体外抗原抗体反应为基础，将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化作用相结合的一种检测方法，灵敏度可达皮克(pg/mL)水平。

常见的ELISA类型双抗体夹心法，其基本原理是将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。

1、包被抗体
许多物质可作为固相载体，如聚丙酰胺和纤维素等，在进行抗体固定化之前，需要对酶标板材进行筛选。酶标板由亲水到疏水，对蛋白的结合会由强变弱，造成吸附能力的差异。将抗体吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求pH在9.0～9.6之间。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：用不同的蛋白质浓度包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本OD值，选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。

2、标准品及样本
标准品即为目标物（样本中待检测因子）的纯蛋白，从母液稀释到级联稀释都需要特别留意，标曲的制作是ELISA实验成功的关键。待检目标物需具备多个抗原表位，即二价或二价以上的大分子抗原，因为这种检测方法需要两种抗体。另外，需要注意的是血清样本中的类风湿因子（RF）干扰——RF能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合而产生假阳性反应。

3、洗涤液
ELISA操作中会涉及到多次洗板。长时间的孵育后，会出现非特异性结合，这时就需要洗涤液来洗去非特异性结合的蛋白或抗体，通常为PBS，洗4-6次，每次30s左右。多次短时间洗板比少次长时间洗板更有效，在最后一次洗板时，尽量拍净液体，同时注意让板子保持湿润。

4、检测抗体
双抗体夹心法中的检测抗体与目标蛋白结合位点需要有别于目标物与包被抗体结合的位点，即会涉及抗体配对的问题。常用的抗体配对方法有下几种：
1）、 包被抗体为单抗，检测抗体为多抗；
2）、包被抗体为单抗，检测抗体为单抗，但这两种单抗针对的抗原表位不同；
3）、包被抗体为多抗，检测抗体为多抗，这两种多抗一般来源于不同的宿主。

5、生物素标记的二抗
鉴于酶标二抗的局限性，现在厂家一般引入生物素亲和素系统(biotin avidin system, BAS)，这种系统在提高反应灵敏度的同时，应用起来也更加方便。进行生物素标记时，可依据抗体所带可标记基团种类（氨基、醛基、巯基等）以及分子酸碱性选择相应的活化生物素和反应条件。生物素标记后，不影响被标记物的生物活性。

6、辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素
每个亲和素分子可与4个生物素分子结合，所以可以偶合更多连接生物素的酶分子，从而大大提高了ELISA实验的灵敏度。生物素和亲和素间的亲和力强，二者一旦结合，就极为稳定，而且这种结合反应时间比抗原抗体反应所需时间短。在BAS检测中多用链霉亲和素“streptavidin, SA”，它是链霉菌培养过程中的分泌物，由4条相同的肽链组成。HRP灵敏，稳定，比活性高，分子量小，纯酶容易制备。其有4对半胱氨酸形成的二硫键，99位Asp和123位Arg形成的盐桥，9个潜在的糖基化位点，有两个金属中心，可催化显色底物TMB产生蓝色一价物。

7、显色底物
由于 TMB比其他显色底物具有更高的灵敏度且无致癌性、故而被广泛使用。HRP 或其他适当过氧化物酶能在过氧化氢存在下催化TMB生成可溶的蓝色物，此时通常可在 370nm 测定吸光度。当显色反应被酸性溶液终止后，产物由蓝色一价物转为黄色二价物，此时可在 450nm 测定吸光度。