取适量未变性的总蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量检测试剂盒（G2026-200T；G2026-1000T）测蛋白浓度，蛋白样品在进行SDS-PAGE电泳等实验研究之前要进行精确的定量，以保证同一实验中不同样品之间上样量的一致性以及结果可比性。因此，蛋白浓度测定是研究蛋白中常用、最基本的分析技术之一。

    BCA原理：在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键结构能与Cu2+结合生成络合物，同时将Cu2+还原为Cu+。BCA试剂可灵敏特异的与Cu+结合，形成稳定的紫色络合物，562nm处有最高的吸收值，可在562nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

蛋白浓度测定方法如下：
1.配制蛋白标准贮备液
取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）蛋白标准管中，将25 mg蛋白标准品全溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。

2.配制蛋白标准工作液
取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。

3.绘制标准曲线（酶标仪法）
将蛋白标准工作液分别按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲线。

4.准备待测样品
将待测的蛋白样品进行适当稀释（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。

5.配制BCA显色工作液
将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存，24 h内使用。每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。

6.检测
向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL，充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30 s），37℃反应30 min后，以标准曲线0号做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。（注：也可以在室温反应2 h，或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应）

7.计算
以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。

提示：
1. BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大，吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化，如果不能精确控制显色反应的时间和温度，建议每次测定都需要做标准曲线。

2. 在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。

3. 为保证蛋白的精确定量，样品的提取和蛋白标准品的稀释配制最好选用相同的缓冲液，同保证两者检测条件一致。如果缓冲液本身就有较高的背景值，建议使用其他的方法测定。

4. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。