逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验过程详解
时间：2024-11-18 阅读：39
逆转录-聚合酶链反应 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）可以：(1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。
实验方法原理:
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
实验过程:
一、总RNA的提取
总RNA提取可以：（1）获得高纯度、高质量的总RNA；（2）可以满足生物学下游实验Northern Blot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR 和阵列分析所需。
二、cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1． 在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，轻轻混匀、离心；
2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；
3． 取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；
4．加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42℃水浴中孵育50 min；
5． 于70℃加热15 min以终止反应；
6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
三、PCR
1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心；
3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
注意事项:
1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；
4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；
5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶处理RNA； 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。