小鼠Ⅲ型前胶原肽 (PⅢNP)酶联免疫吸附测定试剂盒

使用说明书 

（本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!）

声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本产品选用世界生产厂家的原料，采用专业ELISA kit生产技术制造。适用于体外定量检测小鼠血清、血浆、组织匀浆或细胞培养上清液中天然和重组PⅢNP浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！如有疑问，请及时慧颖生物科技有限公司。

试剂盒组成：

*: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠PⅢNP抗体包被于酶标板上，实验时标本或标准品中的PⅢNP会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠PⅢNP抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗小鼠PⅢNP抗体与结合在包被抗体上的小鼠PⅢNP结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下现蓝色，加终止液后变黄。用酶标仪在450nm波长处测OD值，PⅢNP浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过绘制标准曲线求出标本中PⅢNP的浓度。

标本收集:

1.     血清：全血标本于室温放置2小时或4℃一夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.     血浆：抗凝剂推荐使用EDTA.Na2，标本采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂标本。

3.     组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，以去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。zui后将匀浆液于5000×g 离心5~10分钟，取上清检测。

4.     细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

5.     其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测

（具体处理方法可参考：http://www.elabscience.cn/news2.asp?tid=477 ）

6.     标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.     标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃/-80℃冰箱内，避免反复冻融，1-6月内检测,4℃保存的应在1周内进行检测。

8.     如果您的样本中检测物浓度高于标准品zui高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议先做预实验，以确定稀释倍数)。

试验所需自备物品:

1. 酶标仪(450nm波长滤光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒温箱, 双蒸水或去离子水
4. 吸水纸

检测前准备工作:

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶*溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。
3. 标准品: 加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，静置10分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为20ng/ml)。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度： 20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0 ng/ml ，样品稀释液直接作为空白孔0ng/ml。如配制10ng/ml标准品：取0.5mL 20ng/ml的上述标准品加入含有0.5mL样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。
4. 生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。
   1. 酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制  100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。当日使用。

洗涤方法:

1. 自动洗板机：每孔加入洗涤液350μL，注入与吸出间隔60秒。
2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL（在使用前15分钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。
3. 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
4. 每孔加酶结合物工作液（临用前15分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。
5. 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)100μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。
7. 每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
8. 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
9. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存。

注意事项：

1. 保存：试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染，否则可能会出现错误的结果。

1. 酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
2. 加样：加样或加试剂时，*个孔与zui后一个孔的加样时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间控制在10分钟内。推荐设置复孔。
3. 温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态；严格遵守给定的温育时间和温度。
4. 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要注意清除底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。
5. 试剂配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较小，运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用前1000转/分离心1min，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab时，一次不要小于10μL），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-80℃贮存。避免反复冻融。
6. 显色时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟），如梯度已很明显，请提前加入终止液终止反应，避免颜色过深影响酶标仪读数。
7. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
8. 混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，使用微量振荡器(使用zui低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
9. 安全：试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时，请按国家生物试验室安全防护条例执行。
10. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）
11. 试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用，否则将影响试验结果！

结果判断:

1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

灵敏度、检测范围、特异性和重复性:

● 灵敏度：zui小可测0.19ng/ml。

● 检测范围：0.31 – 20ng/ml。

● 特异性：可检测重组或天然的小鼠PⅢNP，且与其它相关蛋白无交叉反应。

● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。

问题分析

说明

1. 限于现有条件及科学技术水平，尚不能对所有原料进行全面的鉴定分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。
2. zui终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的待测样品。
3. 只有全部使用Elab^TM试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守Elab^TM试剂的实验说明才会得到*的检测结果。
4. 有效期：6个月。
5. 本操作说明同样适用于48T试剂盒。