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封闭

在转膜之后，也就是抗体孵育之前，需要对膜进行封闭。封闭是为了使抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有BSA，脱脂奶粉，血清等，一般用的是脱脂奶粉。脱脂奶粉有些特殊情况是不适用的 ，脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用；不能用于磷酸化抗体对蛋白磷酸化的检测；不能用于碱性磷酸酶（AP）显示方法。

抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。

对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。 无论你如何提高自己的转膜技术，和低效之间往往只有数倍的差异， 而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价 不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的zui大化。

一抗：*抗体能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白，包括单克隆抗体和多克隆抗体；二抗：第二抗体能和一抗结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。一般二抗都会偶联可以检测的标记（如荧光、放射性、化学发光或显色基团），用来检测一抗；如果一抗本身偶联有这些标记，则不需要二抗，就是所谓的直接WB。

那么如何正确的来选择二抗呢？*根据一抗的种属来源选择二抗；第二根据一抗的类型选择二抗，根据单体数量和重链分类，将抗体分为IgA，IgD，IgE，IgG，IgM五类。其中又可分为几个亚型：IgA1-2，IgG1a，2a，2b，3，IgM1-2。

显色

酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent 和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。zui为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase 。

常见问题分析：

1.曝光后背景过高且不均匀

封闭不充分：延长封闭时间，更换合适的封闭剂；一抗浓度过高：增加一抗稀释倍数；抗体孵育温度过高：4℃孵育；二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应：设置二抗对照（不加一抗），降低二抗浓度。

洗膜不充分：增加洗膜次数

2.没有阳性条带或很弱

一抗、二抗不匹配：订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物，可通过设置内参验证二级系统的有效性； 更换更好的抗体；一抗，二抗浓度低：增加抗体浓度，延长孵育时间封闭剂与一抗有交叉反应：封闭时使用温和的去污剂，更换封闭剂样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过少，设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低，后者可增加样本上样量；转膜不充分还洗膜过度：使用丽春红S检测转膜效果，PVDF膜需浸透，正确的转膜操作，勿过度洗膜；曝光时间过短：延长曝光时间，更换更灵敏的发光液

3.背景有白色/黑色斑

转膜时有气泡或抗体分布不均：尽量除去气泡，抗体孵育时保持摇动；封闭剂溶解不充分有颗粒状

慧颖 F2-2细胞 ATCC细胞冻存：

１．将细胞消化下来，移入离心管离心，弃上清

２．准备冻存液比例：５０％ＦＢＳ＋４０％培养基＋１０％ＤＭＳＯ（现用现配）

３．加１．５冻存液在离心管中，将细胞吹打均匀，移入冻存管内．

放入－２０度冰箱２－４小时后．再放入－８０度冰箱过ye，第二天放入液氮罐保存.

慧颖 F2-2细胞 ATCC细胞常见的污染如下：

1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，

用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中zui常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢凋亡。

4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。

5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，zui终形成恶性循环。

运输：冻存的细胞干冰运输，复苏的细胞冰袋运输。冬季我们会选择全血清包被细胞株运输，运输途中细胞处于休眠状态，避免天气过冷导致的细胞死亡。