日本同仁Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒

产品名称：Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒

英文名称：Annexin V,FITC Apoptosis Detection Kit

品牌：日本同仁化工

货号：AD02-05

规格：盒

储存条件：0-5℃

货期：现货

细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。正常情况下，任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。例如，体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。然而，在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。 细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。

Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。 Annexin V是一种Ca离子依赖性磷脂结合蛋白，可以与磷脂酰丝氨酸特异结合。用绿色荧光FITC标记的Annexin V通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。

操作流程

-悬浮细胞的操作流程

诱导凋亡的操作步骤

1.制备细胞 (Jurkat cell) 悬液 (1×106 cells/ml)

2.加入终浓度为1 ?g/ml的凋亡诱导剂 (Staurosuporine)

3.在37℃下培养3.5 h。

* Staurosuporine用于诱导Jurkat cell凋亡。*诱导条* Staurosuporine用于诱导Jurkat cell凋亡。*诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。   Annexin V染色操作步骤

1. 将细胞悬液转移到离心管中，1,000 rpm离心3 min，去除上清液。

2. 加入PBS，1,000 rpm离心 3 min，去除上清液。再重复本步操作一遍。

3. 用之前准备好的1×Annexin V Binding Solution制备细胞终浓度为1×106 cells/ml的细胞悬液。

* 细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 ?l细胞悬液。

4. 取100 ?l步骤3中制备的细胞悬液，加入到一个新的tube中。

5. 向细胞悬液中加入5 ?l Annexin V,FITC结合物，再加入5 ?l PI Solution。

6. 室温下避光培养15 min。

7. 加入400 ?l 1×Annexin V Binding Solution，请在1 h内检测。

-贴壁细胞的操作流程

诱导凋亡的操作步骤

1. 制备细胞 (Caco-2) 悬液 (1×106 cells/ml)将细胞悬液接种到培养皿或者培养板中。

2. 在5% CO2培养箱中37℃预培养。

3. 加入终浓度为25 ?mol/ml的凋亡诱导剂 (Cisplatin)。

4. 37℃培养4 days。

* Cisplatin用于诱导Caco-2 cell凋亡。*的诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。

Annexin V染色操作步骤

1. 吸取培养皿或培养板中的上清液丢弃或转移至微型管中保存。

2. 用PBS洗细胞2次，丢弃或收集清洗液保存。

3. 用胰蛋白酶消化细胞。

4. 用适量的培养基或PBS将细胞悬液转移至离心管中，如果*步的上清液和第二步的清洗液没有丢弃，可以一并加入。

5. 1,000 rpm离心3 min，弃上清。

6. 加入PBS后1,000 rpm离心3 min，弃上清。重复本步操作一遍。

7. 加入预先配好的1×Annexin V Binding Solution，制成终浓度为1×106 cells/ml的细胞悬液。

* 细胞悬液体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 ?l细胞悬液。

8. 取100 ?l步骤7中的细胞悬液，加入到新的tube中。

9. 向细胞悬液中加入5 ?l Annexin V, FITC结合物，再加入5 ?l的PI Solution。

10. 室温下避光培养15 min。

11. 加入400 ?l 1×Annexin V Binding Solution，请在1 h内检测。

备注：1. 上清液及清洗液中可能含有细胞或凋亡细胞，可以收集一起处理。

      2. 离心后如果无法判断tube中是否含有细胞？可以保留上清液，以防检测时没有细胞，进而得不到实验结果。

-设定对照

1. 未染色细胞。

2. Annexin V, FITC染色细胞 (没有PI)。

3. PI染色细胞 (没有Annexin V-FITC)。

-流式细胞仪检测

1. 加样到流式细胞仪检测，激发波长Ex = 488 nm；发射波长Em = 530 nm。

2. Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道 (FL1) 检测；PI的红色荧光通过PI 通道 (FL2或FL3) 检测 (建议使用FL3)。

-荧光显微镜检测

  将细胞悬液滴到玻片上，置于显微镜上使用合适的滤光片检测。

* 由于EDTA会对细胞膜的特定部位有损伤，建议使用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。

注意事项

1. PI有潜在的致癌性，操作时请特别注意并采取必要的防护措施。

2. Annexin V,FITC和PI均对光敏感。所有染色过程和培养过程均需避光。

3. 若细胞收集过程中使用胰酶，需设法去除残留的胰酶，这些胰酶会消化并降解Annexin V, FITC，zui终导致染色失败。