ibidi提供了一个简单经济高效的方案，使用可移除的12孔腔室载玻片进行细胞的培养，固定和染色。培养MCF-7细胞并用formalin溶液固定。细胞核用DAPI和肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔环肽染色。可以使用一抗和二抗染色通过免疫细胞化学探测其他细胞内结构。

德国ibidi 81201载玻片

实验使用的材料和试剂列于下面。

• 12孔腔室载玻片，可移除（ibidi，81201）

• 用于腔室的盖玻片，可移除，24mm x 60 mm（ibidi，10811）

• 细胞：MCF-7（CLS，300273）

• 细胞培养基

• 细胞培养试剂

• 聚苯硫醚

• formalin溶液中性缓冲液，10％（Sigma，HT5011）

• 染色试剂

o  DAPI（Sigma，D954）

o  DYE-490鬼笔环肽（Dynomics，490-33）

• 安装介质：FluoroshieldTm值（Sigma，F6182）

实验方案：

步骤1：

必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用2-6x10 4细胞/ ml在2-3天内产生汇合的单层。
1.打开12孔可移除腔室载玻片（ibidi，81201）包装，在无菌条件下可拆除。
2.像往常一样用胰蛋白酶消化并计数细胞。细胞浓度为5×104细胞/ ml MCF-7。
3. 将250μl细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。
4. 用配套的盖子盖住。在37°C和5％CO2下培养。细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层

步骤2：

固定是染色程序的第一步。目标是将细胞，细胞形成物或组织维持在其当前状态，并在较长时间内通过化学试剂保存。
1.小心地吸出细胞培养基。
2.用PBS洗两次。
3.加入250μl的formalin溶液。
4.在室温下孵育30分钟。
5.小心吸入formalin溶液。
6.用PBS洗涤三次。

步骤3：

应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。
1.准备你的染色溶液：· 聚苯硫醚· DYE-490鬼笔环肽· DAPI 1µg/ml
2.小心吸出PBS。
3.移取250μl染色溶液到每个孔中
4.在室温下避光孵育30分钟

步骤4：

在染色后清洗你的样本会使背景信号降到很低   
1.小心地吸出染色溶液 
2.加入250μl缓冲液     
3.小心吸入缓冲液   
4.重复步骤2和步骤3一次

步骤5：

从一个边部开始，用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以避免损坏细胞层。

步骤6：

完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还防止样品脱水。
1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，从样品中去除多余的介质。
2.将封固剂涂在样品上。用24毫米x 60毫米的盖玻片覆盖安装的样品，小心地将盖玻片放到安装介质上，以避免夹住任何气泡。推荐使用诸如FluoroshieldTm值（Sigma-Aldrich），Vectashield®（Vector Laboratories Inc.）或ProLongAntifade®（ThermoFisher Scientific）的硬化封固剂。
3.安装封固剂固化。

步骤7：显微观察

使用12孔可移除载玻片培养MCF-7细胞，用DAPI和DYE 490鬼笔环肽染色细胞结构。使用硬化封固剂安装载玻片保存样品以便长期储存。
图1用DYE490鬼笔环肽（左上）染色MCF-7细胞的肌动蛋白骨架，并用DAPI（右上）染色细胞核。下图显示了合成图像，其中细胞核为蓝色，肌动蛋白骨骼为绿色。（比例尺：100μm）