如何创建令人惊叹的细胞球体3D图像

　　第一部分：µ-Slide球体灌注中的球体形成和培养

　　请在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前阅读指示。所有步骤均需在无菌条件下执行。

　　开始实验之前，在标准细胞培养瓶（例如 T75）中制备 L929 成纤维细胞，细胞粘附在底部。细胞在实验当天应该是健康的并且*佳亚汇合。

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培养箱内过夜平衡所有必需的材料，例如载玻片、培养基和管道（灌注套件）。平衡对于防止气泡随着时间的推移而出现至关重要。

　　1. 将60 µl 无细胞培养基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每个通道（根据说明用提供的盖玻片封闭）　　

　　2. 在培养箱中 37°C 孵育 2 小时。孵育期间始终关闭盖子。　　

　　3. 用 Accutase 处理培养的 L929 细胞 1-2 分钟以使其脱离。　　

　　4. 收集细胞悬液，离心，在培养基中稀释；量取决于所需的细胞浓度。　　

　　5. 对细胞计数并调整至终浓度为 5 x 105cells/ml。　

　　6. 用无细胞培养基冲洗 µ-Slide 球体灌注的通道，以去除潜在的气泡。　　

　　7. 将 45 µl 细胞悬液直接移入每个通道。　　

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小时，使细胞在壁孔中沉淀。　　

　　9. 用60 µl 无细胞培养基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的储液库。　　

　　10. 在 37°C 下孵育过夜以形成球体。　　

　　11. 检查通道是否有气泡。如果通道中存在任何气泡，请用无细胞培养基小心冲洗通道。　　

　　12. 使用ibidi 串行连接器连接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 个通道　　

　　13. 根据ibidi 泵系统、流体单元和灌注装置指示。　　

　　14. 将µ-Slide 球体灌注连接到 ibidi 泵系统并开始流动。使用尽可能低的流速（5 mBar 气压导致流速为 0.74 ml/min）。进行实验，直到球体具有所需的成熟状态，在这种条件下培养 7 天后。　　

　　图1：L929 成纤维细胞在孔中形成球体并在流动条件下培养

　　图 2：L929 成纤维细胞在µ-Slide 球体灌注中显示球体形成。第1 天的示例

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系统灌注，0.74 毫升/分钟。相差显微镜，10 倍物镜，井径 800 µm。

　　第二部分：L929 球体的染色和清除

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中进行。在开始染色之前，请阅读指示并遵循载玻片中关于一般移液和更换溶液的建议。

　　1. 当 L929 球体培养达到所需的成熟状态（此处为 7 天后）时，小心地断开 µ-Slide球体灌注与 ibidi 泵系统的连接。　　

　　2. 在 RT 处用冷 IC 固定缓冲液固定球体 10 分钟。　　

　　3. 在 RT 中将球体封闭和染色缓冲液中孵育 1 小时。　　

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球体过夜。从这一点开始，保持载玻片避光。图 3A 显示了清除前的球体成像。　　

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗细胞一次。　　

　　6. 通过在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的异丙醇稀释液孵育15 分钟，依次使球体脱水。　　

　　7.  在冰上用纯异丙醇孵育球体两次 15 分钟。　　

　　8.  从冰中取出载玻片，让它升温至 RT。　　

　　9.  执行清除：在 RT 处用纯 ECi 灌注两次。在这个阶段，球体可以避光储存数周，而不会显着损失荧光。　　

　　10.  使用共聚焦显微镜的图像球体（参见图 3）。　　

　　图 3：清除前后染色 L929 球体的共聚焦显微镜（红色：鬼笔环肽，青色：DAPI）。

　　(A) 清除前的球体。请注意，由于光散射和吸收，只能看到外围细胞，而看不到中心的细胞。(B, C) 清除后的球体。请注意，清洗前后的尺寸差异源于脱水和清洗过程，同一位置的横截面。(B) 横截面 (C) 体积/3D 视图。球体的清除允许即使在球体成纤维细胞的中心也可以看到细胞，同时保留球体的形态。细胞核的计数甚至可以确定形成该球体的细胞数。

　　注：此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者　　

　　仅供科研使用！