ibidi血管生成实验实验装置优化和数据分析操作

　　µ-Slide 血管生成载玻片

　　1.选择正确实验方案　　

　　进行血管形成分析的第一步是确定实验方案。需要考虑三个最重要的考虑因素，分别是：　　

　　· 细胞类型——内皮细胞中生理性地观察到管形成　

　　· 凝胶基质——它需要与细胞相容，并且必须为细胞附着提供结合基序　　

　　· 培养基成分（要求生长因子）　

　　2.实验前工作　　

　　在开始筛选实验之前，务必要做优化实验程序和设置。

　　2.1. 实验装置的优化　　

　　细胞接种密度、数据采集时间点和血清浓度对数据值有很大影响。因此，创建严格对于生成可重复的数据和数据集之间的可比性至关重要。

　　2.1.1. 测量时间间隔

　　首先，选择细胞浓度和促进血管形成的设置来记录时间曲线。对于人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 每孔约 10,000 个细胞，使用具有减少生长因子的基质胶TM值和不含血清或生长因子的细胞培养基就足够了。

　　接下来，按照应用说明制备凝胶和细胞悬液，“ibidi µ-Slide 血管生成的形成分析”。在凝胶表面播种细胞后，立即将载玻片放入显微镜的培养室中，并开始延时记录。每 10 分钟记录一张图像，使用基于软件的工具在每个时间点调整焦点。或者，如果您的显微镜上没有孵化室，则每小时记录一次图像，至少在前 8 - 10 小时内。记录每个图像后立即将样品放入细胞培养箱中。在过夜培养后记录最终图像。

　　最后，分析图像并使用合适的软件可视化曲线。参数（例如，总管长）的时间曲线通常如下图所示。曲线上升到最大值（约 5 小时），然后下降到平均期（约 7 小时开始），然后慢慢变平（> 20 小时）。由于所有四个关键参数的特征看起来相似，只评估一个参数就足够了。我们选择管总长度作为参数，因为原始图像提供了一个控制，可以轻松地与评估图像进行比较。

　　24小时内管长的时间响应

　　最佳结果出现在最大阶段以及不会迅速下降的稳定阶段。在上例中，4 小时时间点和 10 小时时间点是很好的测量参考点。

　　2.1.2. 细胞接种密度　　

　　要确定最佳细胞接种密度，请记录细胞系的特征。

　　首先，在 5-40 x 10 3cells/ml 范围内进行一系列稀释，然后将细胞接种到凝胶表面。按照第 4.1.1 节中的说明将样品孵育确定的时间长度，并记录相衬图像。每个细胞浓度执行五次重复。

　　评估图像，分别在第 3 节和第 5 节中提到。将数据可视化为图表，如下所示。数据将显示具有最大值的特性曲线。该最大值是您的细胞类型的*佳接种密度。

　　HUVEC 和 EA.hy926接种4小时后的密度响应

　　2.1.3. 血清浓度　　

　　向培养基中添加血清可能会影响试管形成行为。在大多数情况下，血清抑制管形成。为避免此问题，请使用您在第 4.1.1 节和第 4.1.2 节中确定的条件测试不同的血清浓度，范围为 0 - 20%。这将确定哪种血清浓度适合于血管生成和细胞存活。

　　2.1.4. 放大倍数　　

　　放大倍数决定了能够被相机成像的孔区域。由于管的形成发生在孔的整个表面区域，重要的是尽可能地对最宽的部分进行成像。如果不需要检测细胞内细节，请使用低倍率（4 倍或 5 倍）。如果需要检测细胞内细节，建议对每个孔拍摄几张放大倍数更高的图像并将它们拼接在一起

　　2.2. 建立阳性和阴性对照　　

　　要创建阳性对照，请选择确保血管形成的实验系统（例如，具有减少生长因子的基质胶TM值和用于 HUVEC 的无血清培养基）。阳性对照确保细胞是健康的，并且观察到的任何抗血管生成作用都是由所研究的物质引起的。

　　要创建阴性对照，请选择一种经证实对血管形成发展具有抑制作用的物质（例如，用于 HUVEC 的苏拉胺）。阴性对照确保可以抑制细胞中的管形成，并为您的实验结果提供一个比较点。

　　2.3. 实验计划和重复次数　

　　在进行实验之前，计算所需材料的数量，例如细胞、培养基、凝胶基质和物质。还要计算实验室设备和空间要求以及时间表。

　　为了正确地进行统计分析，建议至少进行四次独立实验，每个实验至少有 8 个单孔。所需的实验次数取决于数据的均匀性。遵循严格的协议对于数据采集至关重要。

　　对数据集执行学生 T 检验。p 值 ≤ 0.05* (≤ 0.01**) 表示该模型有足够的功效，无需额外实验即可继续。

　　2.4. 文档　　

　　合理的文档包括本节中确定的所有参数。生成一个表格图表，其中每个实验都记录在一列中。附录中给出了一个例子。

　　3.数据分析

　　每个分析孔生成一个管长度值。然后将一个实验（每个条件至少 8 个孔）的值相加并计算标准偏差。标准偏差应小于 10%。这只是一个实验数据点。

　　左图显示了在四个不同时间点，一种实验条件下单孔结果的分布。右图显示了一种实验条件在四个不同时间点的平均结果。

　　为了正确稳定的统计分析，每个条件至少需要四个数据点。请记住，每个数据点由 8 个单独的孔组成。　　

　　单个数据点合并为一个平均值，并可以显示在条形图中。统计分析是通过学生 T 检验完成的，其中对不同的数据点群体进行相互检验。