伤口愈合测定是一种研究体外细胞迁移的简单方法。ibidi Culture-Insert 伤口愈合插件系列产品为伤口愈合实验提供了完整的解决方案，从样品制备到图像分析只需四个步骤。

　　本应用是使用ibidi Culture-Insert 2 Well伤口愈合插件分析MCF-7细胞迁移的详细方案。

图 1. 使用ibidi Culture-Insert 2 Well行伤口愈合测定的实验工作流程

　　实验操作流程：

　　步骤1:细胞接种

　　为建立可靠的数据采集系统，须在实验开始前确定实验参数。例如：选择正确的细胞接种密度。我们建议使用24小时后产生百分之100光学融合细胞层的密度。

　　1.像往常一样准备细胞悬液。建议包括离心步骤，以去除死细胞和细胞碎片。将细胞悬浮液调节至约3x105个细胞/ml的细胞浓度，以在24小时后获得融合的细胞层。

　　2. 将70µl细胞悬液滴入培养皿2孔插件的每个孔中。避免摇晃µ-Dish培养皿，因为这将导致细胞分布不均匀。

　　3. 将细胞在37°C和百分之5 CO2下培养至少24小时。

图2. 在高壁预置伤口愈合2孔插件培养皿中接种细胞

　　步骤2:划痕形成

　　融合细胞层是开始该测定的先决条件。移除高壁伤口愈合2孔插件培养皿后加入新鲜培养基。如有必要，在培养基中补充抑制或增强物质，以评估其对细胞迁移行为的影响。

　　1. 24小时后在显微镜下检查细胞密度。如果24小时后仍未形成细胞融合层，则将µ-Dish培养皿再次放入细胞培养箱中再培养12-24小时。定期检查汇合处。

　　2. 用无菌镊子轻轻取出伤口愈合2孔插件培养皿。如图3所示，用镊子轻轻夹住插件的一角取出插件。

图3.使用无菌镊子移除伤口愈合2孔插件培养皿

　　3.移除插件后，检查细胞层是否仍附着在μ-Dish培养皿的表面。

　　4.用无细胞培养基或PBS清洗细胞层，去除细胞碎片和未附着的细胞。

　　5.推荐使用体积为2mL的无细胞培养基填充μ-Dish培养皿。

图4. 由高壁预置伤口愈合2孔插件培养皿创建的无细胞间隙

　　步骤3：获取显微镜图片：

　　我们建议录制延时视频，以确定时间依赖性和细胞迁移的特征。

　　1. 将培养皿放在显微镜上并移动，直到图像中捕捉到间隙和两个细胞的正面。使用4x/5x或10x物镜。伤口区域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

　　2. 在接下来的几个小时内，通过多次拍摄图像开始观察过程。

　　3. 以30分钟的时间间隔对在ibiTreat表面上培养的MCF-7细胞进行20小时的时间推移测量。

图5.使用MCF-7细胞的迁移测定的时间流逝测量

　　步骤4：使用FastTrack AI和数据解释进行定量图像分析

　　必须分析显微照片以获得关于培养细胞的迁移特征的信息。这可以通过使用图像处理软件手动完成，也可以通过使用ibidi提供的伤口愈合快速通道人工智能图像分析进行自动图像分析。

　　这里显示的示例数据是使用FastTrack AI进行分析的。自动图像分析检测细胞覆盖面积。绘制细胞覆盖面积随时间的变化图，显示间隙闭合的过程。线性相位可以用来表征迁移(=伤口闭合的速度)。

　　线性相的斜率显示，划痕闭合的平均速度为0.0184*106µm²/小时（=0.44*106µm²/天）。

图6. FastTrack AI对伤口愈合实验的定量图像分析

　　高壁预置伤口愈合2孔插件培养皿放置在细胞培养表面上，提供两个细胞培养库，每个库由一条500μm壁隔开。在两个储液库中填充细胞悬浮液仅允许细胞在设置区域生长。移除培养插件在适当的细胞附着后，产生大约500 μm的无细胞间隙。

　　在显微镜评估伤口愈合过程。根据您感兴趣的焦点，可以通过使用视频显微镜或通过在不同时间点观察图像来完成。测量细胞覆盖区域的变化允许量化伤口闭合的速度并提供细胞迁移特征。