实验原理

生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中．它们的净电荷取决于介质的H 浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移．迁移的方向取决于它们带电的符号．这种迁移现象即谓电泳。迁移的方式目前可以根据分子尺寸大小、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特性分为三类。如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有一定迁移速率的驱动力来自于颗粒的有效电荷Q和电位梯度E。它们与介质的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中，这种抗衡服从斯托克斯定律。f=6πrvη 这里v是在介质粘度为η半径为r的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种抗衡并不*符合斯托克斯定律。f还取决于介质小的其他因子，如凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至介质的内渗率等。简言之电泳就是带电颗粒在电场中定向移动。
银染显色的原理是用甲醛将沉积在DNA带上的银离子（硝酸银）还原成金属银而显带。

实验试剂

1. 聚丙烯酰胺（C=30% T=5%）：丙烯酰胺 28.5g 、 N，N’-二甲基双丙烯酰胺 1.5g、DDH₂O 100ml；

2. 7％聚丙烯酰胺：30％聚丙烯酰胺 23.3ml、10ml 10×TBE溶液、66.7ml DDH₂O；

3. 10×TBE溶液：Tris 113g 、硼酸 55g、 1000ml DDH₂O；

4. 1×TBE溶液：10×TBE溶液100ml，900ml DDH₂O；

5. 10%乙醇；

6. 0.1%硝酸；

7. 0.2%AgNO₃：

8. AgNO₃ 0.15g、DH₂O 225ml；

9. 30%NaCO₃-甲醛：NaCO₃ 30g、甲醛 0.85ml；

10. 0.1% AgNO₃：AgNO₃ 1g、1000ml DH₂O；

11. 上样缓冲液：0.25％二甲苯氰蓝、0.25％溴酚蓝；

12. TEMED；

13. 10％过硫酸胺：过硫酸胺1g、10ml DDH₂O。

实验设备

1. 垂直电泳仪

2. 垂直电泳槽

3. 玻璃

4. 橡胶模框

5. 点样梳

6. 摇床

7. 微量进样器

8. 染色托盘

实验材料

PCR扩增产物

实验步骤

1. 电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，烘干，将两块玻璃装入恰当德橡胶模框内，并组装好电泳槽（带长玻璃的贮液槽为正极，带短玻璃的贮液槽为阴极）。
2. 制胶：加 35μl TEMED和300μl2.5％过硫酸胺至7％聚丙烯酰胺溶液中混匀。以60O角，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1小时。向电泳槽内灌入 1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
3. 加样：取2-4μl扩增产物和2μl上样缓冲液混匀,用微量进样器小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可适当增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
4. 电泳：电泳槽接上电极开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
5. 银染法显色：
   1) 方法一：

      a. 将PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min，用纯水洗一次；
      b. 0.1%硝酸3min，蒸馏水洗两次。
      c. 0.2% AgNO₃溶液中10min，用去离子水洗三次；
      d. 用30% NaCO₃-甲醛溶液显色至满意为止，用适量10%冰乙酸终止显色。
   2) 方法二：

      a. 取下凝胶，蒸馏水清洗凝胶30秒；

      b. 0.1% 硝酸银染色10分钟；

      c. 弃去染色液，蒸馏水洗胶两次；

      d. 显色液（显色液配方：10g NaOH 0.2g Na₂CO₃ 2ml甲醛溶液，定溶到 500ml）显色至满意为止。
6. 分型：参照基因阶梯的电泳谱带进行分型。

注意事项

1. 每加完一个样品要清洗微量进样器,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
2. 以二甲苯氰蓝和溴酚蓝的位置大致判断泳动距离，7％聚丙烯酰胺非变性胶中溴酚蓝相当于170bp的泳动距离，二甲苯氰蓝相当于40bp的泳动距离。
3. 银染时显色液配制好在4-10 ℃预冷可以减轻胶板的底色，银染后胶板在水中漂洗时间控制在10s以内。