多药抗药基因的表达实验

一、细胞总RNA提取

1.  收集约5×10⁷个细胞，冷PBS洗涤。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的异硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸钠，0.025 mol/l 构橼酸钠pH7.0，0.25 mol/l 乙酸钠，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混匀。

3.  加入400 ul 氯仿，混匀，以13 000 r/min 于4℃离心15 min。

4.  取上清液加入等体积的异丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 离心15 min，吸上清，将RNA成点用75%的乙醇洗涤1次，溶于100 ul 的无菌双蒸馏水中。

6.  并用紫外分光光度计检测RNA纯度（A₂₆₀/A₂₈₀应为1.8~2.0）后备用。

二、反转录及PCR扩增

1.  引物
 

2.  取细胞总RNA10 ul 加入20 ul AMV逆转录酶反应体系中，42℃保温30 min 进行反转录，合成cDNA。

3.  然后置95℃，3 min 终止反转录。

4.  接着在Taq酶的作用下，用mdr-1和β₂-MG引物，对cDNA上的目的片段进行PCR

5.  94℃预变性2 min，然后94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，扩增35个循环。

6.  zui终在60℃保温7 min，以保证产物充分延伸。

7.  取10 ul 扩增产物在3%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下照相，与mdr-1 cDNA阳性对照，等位的DNA条带为阳性，反之为阴性。