1.  用限制性内切核酸酶消化DNA以获得目的DN段，将靶片段双向克隆到M13噬菌体载体或含有M13复制起始子的质粒载体中。从100 ml 感染细抱培养物中提取单链DNA。

2.  在三个微量离心管内各加入40 μg 1 mg/ml 的单链DNA，如果靶序列的两条链都要被利用，则需用6个反应。

 

3.  亚硝酸反应：在一个管内加入10 μl pH4.3的2.5 mol/l 乙酸钠和50 μl 2 mol/l 亚硝酸钠，混匀，室温温育60 min。

4.  甲酸反应：在另一管内加60 μl 浓甲酸，混匀，室温温育10 min。

5.  肼反应：在第三个管内加60 μl 浓肼，混匀，室温温育10 min。

6.  毎管加100 μl 2.5 mol/l pH5.5的乙酸钠，30 μg 担体tRNA和1 ml 无水乙醇，置干冰中冻至-80℃，放置10 min，离心10 min，去上清，重复乙醇沉淀两次，再用80 μl TE缓冲液重悬DNA。

7.  在重悬的DNA内加10 μl 4种dNTP混合液，10 μl 10×反转录酶缓沖液和100 pmol 的寡核苷酸引物。先在85 ℃温育5 min，再于40℃温育15 min。

8.  加10 μl 4种dNTP混合液和30~40 U 的AMV反转录酶，37℃温育1 h。

9.  用缓冲液平衡酚抽提和乙醇沉淀DNA，DNA重悬于100 μl 10×限制性内切酶缓冲液，并用适当的限制性内切酶切割，以便从载体中回收片段。

10.  酚抽提和乙醇沉淀DNA。DNA重悬于10~15 μl 洗脱缓冲液，并加0.5 μl 2 mg/ml RNA酶A，37℃温育15 min 以降解担体tRNA。

 

11.  在非变性的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳上，分离从载体上切下的目的片段，凝胶用溴化乙锭染色，切胶，洗脱出DNA。

12.  将纯化的插入DNA连接到具有互补末端的质粒或细菌噬菌体载体中。通过常规的转化程序将连接混合物导入合适的细菌中