DNA实验技术：基因转染（磷酸钙-DNA共沉淀法）磷酸钙-DNA共沉淀法
时间：2013-08-22 阅读：2466
磷酸钙-DNA 共沉淀法
核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时，可使DNA 附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA 仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA 可以与细胞DNA 整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA 导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是zui常用并的方法。
1、配液
（1）2×HBS 1.63g NaCl
1.19g Hepes
0.023g Na2 PO4 、2H2 O
加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存
（2）2mmol/L CaCl2 过滤除菌
（3）TE：0.1mmol/L EDTA
1mmol/L Tris-HCL PH8.0
（4）G418（新霉素G418）液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。
（5）G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L
注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的zui低浓度。
2、操作步骤[方法一]：
（1）供体DNA 制备：方法按前介绍的DNA 提取法提取，溶于TE中，40mg/L。
（2）受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。
（3）DNA -磷酸钙沉淀物的制备
①将供体细胞DNA 和PSV2-neo质粒载体DNA 用TE配制成40mg/L的DNA 溶液，同时向供体细胞DNA 液200μl中加入带基因neo质粒DNA 液（20mg/L）220μl和2×HBS 250μl（PSV2-neo为1～2mg/L的使用量）。
②取500μl上述DNA 溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混匀30秒。
③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。
（4）转染受体细胞
①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。
②吸取0.5ml DNA -磷酸钙沉淀，加入含5ml培养液的细胞瓶中摇匀。
③置37℃ 5% CO2 培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA -磷酸钙结晶颗粒。
④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。
⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。
⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。
⑦2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆 出现，待其增大后再进行化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。
本实验要加入PSV2-neo、DNA 与外源DNA 共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素（neo）基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。若以获取“转化灶”为目的，可不加入PSV2-neo DNA 只需将从癌细胞中提取的DNA 导入受体细胞即可，其方法如下：
3、DNA 转染[方法二]：
（1）配制磷酸转染液
NaCl 8.0g
Hepes 5.0g 用时现配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65
Na2HPO4 0.099g 消毒灭菌 -20℃贮存备用
加温水至 1000ml
（2）按前面介绍的方法提取癌细胞DNA 。
（3）取供体DNA 50～100μg,加3M NaCl或醋酸钠，使zui终浓度至0.3M混匀。
（4）再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟，去上清。
（5）加入转染缓冲液，待DNA 充分溶解后，再加入2.5MCaCl2 ,含zui终浓度为125mM，用吸管轻轻吹打三次（不用搅拌器以防DNA 袢结），置室温下10～30分钟，待液体透明度降低，出现微浊兰色时，即可用于转染细胞。
（6）取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞，在转染前4小时，更换培养液（5ml/瓶）1次。
（7）转染：向每瓶中加DNA -磷酸钙沉淀物0.5～1ml/瓶，置37℃作用4～6小时。
（8）培养：弃去培养液，用15%处理3分钟，无血清培养漂洗1次，接近汇合时血清用量降至5%，培养2～3周。
（9）检测：逐日观察，待出现“转化灶”后，分离，扩大培养建立转化细胞株。
脂质体介导DNA 转染法
脂质体（lipofectin regeant,LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1（w/w）]。它适用于把DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下zui方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA 和RNA 转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：*，先要固定一个DNA 的量和DNA /LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA 可从1～5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA 两者*的剂量，确定出转染时间（2～24小时）。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤[方法一]：
（1）：取6孔培养板（或用35mm培养皿），向每孔中加入2ml含1～2×105 个液，37℃CO2 培养至40%～60%汇合时（汇合过分，转染后不利筛选细胞）。
（2）转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA ，终量100μl，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μl,轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染（如出现沉淀可能因LR或DNA 浓度过高所致，应酌情减量）。
（3）转染准备：用2ml不含血清培养液漂洗两次，再加入1ml不含血清培养液。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
（5）其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：
（1）以5×105 细胞/孔接种6孔板（或35mm培养皿）培养24小时，使其达到50～60%板底面积。
（2）在试管中配制DNA /脂质体复合物方法如下：
①在1ml无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA 或供体DNA 。
②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。
③室温下放置5～10分钟，使DNA 结合在脂质体上。
（3）弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1ml DNA /脂质体复合物，37℃培养3～5小时。
（4）再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14～24小时，
（5）吸出DMEM/DNA /脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2ml/孔，再培养24～48小时。
（6）用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
稳定的脂质体转染方法如下：
（1）接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。
（2）DNA /脂质体复合物制备转染细胞同前（2）、（3）步骤。
（3）在每孔中加入1ml、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。
（4）吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆 ，方法参照细胞筛选法进行。
DEAE-葡聚糖转染法
DEAE-葡聚糖介导的转染，其原理还不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA 转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验，转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA /DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系，可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖（1g/L）作用较短时间（30分钟-1.5小时），又可用较低浓度（250g/L）的DEAE-葡聚糖作用较长时间（8小时）。
方法如下：
（1）接种鼠L成纤维细胞浓度为5×105 CO2 /孔/皿生长2～3天，当达50%板底面积可用。
（2）乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo质粒DNA ，空气干燥后溶于40μL的TE中，或取供体DNA 。
（3）用10ml 1×PBS、4ml、10%富合生长因子血清的DMEM洗板（皿）。
（4）在80μl热的10g/L DEAE-葡聚糖中缓慢加入DNA ，取120μl DNA /DEAE-葡聚糖加到每孔（皿）细胞中，使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色，培养4小时。
（5）从孔（皿）中吸出DNA /DEAE-葡聚糖，加入5ml 10%DMSD，室温放置1分钟，吸出DMSO，用5ml 1×PBS洗一次吸出，加入10ml培养液（10%血清的DMEM）。
（6）培养细胞，在适当时间分析细胞，若含有抗药基因，可用G418选择培养液培养，方法同前。
*，科研工作者在进行医药方面的科学研究之前，需要制定完善的统计研究设计方案，那么什么样的设计方案才称得上是完善的呢？ 一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：实验所需的人力、物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原则”，是科学实验设计的核心。