ELISA试剂盒生产标准操作规程
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一、生产定量
1．生产材料
1.1 包被液
1.2 磷酸盐缓冲液
1.3 标准品稀释液
1.4 样品稀释液
1.5 封闭液
1.6 抗体稀释液A1
1.7 酶稀释液E1/E2
1.8 洗涤液
1.9 底物液A液
1.10 底物液B液
1.11 终止液
2．使用仪器设备
2.1 冰箱
2.2 生化培养箱
2.3 洗板机
2.4 酶标仪
2.5 涡旋仪
2.6 天平（感量0.01）
2.7 氮吹仪
3．EL1SA检测方法的建立
3.1 多因素正交试验（抗原*包被浓度及抗体工作浓度的确定）
在ELISA实验中必须首先对抗原的*包被浓度以及抗体的工作浓度予以选择，从而达到抗原抗体二者之间的*反应条件。ELISA实验中通常采用正交试验来对二者之间的*反应条件进行确定（实验设计如表2.1）。
表2.1 ELISA加样示意表
| 抗体稀 释倍数 | 抗原稀释倍数 | |||||
| 1 : 10 000 | 1 : 20 000 | 1 : 40 000 | 1 : 80 000 | 1 : 160 000 | 1 : 320 000 | |
| 1:10000 | | | | | | |
| 1:20000 | | | | | | |
| 1:40000 | | | | | | |
| 1:80000 | | | | | | |
| 1:160000 | | | | | | |
| 1:320000 | | | | | | |
具体操作步骤如下：
① 包被：将包被抗原用包被缓冲液做系列稀释，每孔取100 mL加入酶标板，包被条件如下：
| 包被温度 （℃） | 包被时间 （hour） | |||||
| □ 4℃ | □ 27℃ | □ 37℃ | □ 2 h | □3 h | □18h | □24h |
② 洗板：甩去孔内液体，用洗板机洗涤微孔2次（或每孔加入250 mL洗涤缓冲液洗涤），每次静置10 s，zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上拍干；
③ 封闭：每孔加入180 mL封闭液，37 ℃放置1.5 h；甩去孔内液体，不经洗涤直接在吸水纸上拍干；
④ 烘干：采取再次烘干或者晾干的方式*干燥酶标板。烘干：37 ℃倒置（不加盖板膜或用自封袋），每5块板烘干30 min，随着板子数量增多时间相应延长，如100块板，需要烘3 h，一次类推；晾干：底部铺一层干净的A4纸或者吸水纸，倒置板子，在顶层铺一层盖住避光，室温晾18-24h。
⑤ 正交试验：根据不同的检测物质采用一步法或两步法进行实验。
（1）一步法操作步骤：
取出所需的不同包被浓度的板条，按照设计的对应孔每孔依次加入50 mL 包被液（零标准）、50 mL 1000倍稀释的HRP酶标物、50 mL系列稀释的抗体，孵育条件如下：
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | ||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔内液体，每孔加入250 mL洗涤缓冲液，静置20 s后，再次甩去孔内液体。重复洗涤微孔3次，zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育条件如下表：
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | |||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
终止：每孔加入50 mL 终止液；
读数：用酶标仪在双波长450 / 630 nm测定每孔OD值，分析软件分析数据。
（2）两步法操作步骤：
取出所需的不同包被浓度的板条，按照设计的对应孔每孔加入50 mL 包被液（零标准）和50 mL系列稀释的抗体，孵育条件如下：
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | ||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔内液体，每孔加入250 mL洗涤缓冲液，静置20 s后，再次甩去孔内液体。重复洗涤微孔3次，zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；
酶标物：每孔加入100 mL 1000倍稀释的HRP酶标物，孵育条件如下；
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | |||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □15 min | □20 min | □30 min |
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育条件如下表：
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | |||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
终止：每孔加入50 mL 终止液；
读数：用酶标仪在双波长450 / 630 nm测定每孔OD值，分析软件分析数据。
针对上述结果，选择OD值在2.200 - 2.500范围内所对应的抗原、抗体稀释倍数，然后根据此条件下建立的标准曲线及IC50值等条件，进一步确定包被抗原和抗体的工作浓度。
3.2 酶标免疫测定程序（标准曲线工作条件的选择）
（1）一步法操作步骤：
选择抗原合适包被浓度的板条，按照设计的对应孔每孔依次加入50 mL 标准品/样品、50 mL 1000倍稀释的HRP酶标物、50 mL合适浓度的抗体，孵育条件如下：
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | ||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔内液体，每孔加入250 mL洗涤缓冲液，静置20 s后，再次甩去孔内液体。重复洗涤微孔3次，zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育条件如下表：
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | |||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
终止：每孔加入50 mL 终止液；
读数：用酶标仪在双波长450 / 630 nm测定每孔OD值，分析软件分析数据。
（2）两步法操作步骤：
选择抗原合适包被浓度的板条，按照设计的对应孔每孔加入50 mL标准品/样品和50 mL合适浓度的抗体，孵育条件如下：
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | ||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔内液体，每孔加入250 mL洗涤缓冲液，静置20 s后，再次甩去孔内液体。重复洗涤微孔3次，zui后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；
酶标物：每孔加入100 mL 1000倍稀释的HRP酶标物，孵育条件如下；
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | |||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □15 min | □20 min | □30 min |
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育条件如下表：
| 孵育温度 （℃） | 孵育时间 （min） | |||
| □ 室温（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
终止：每孔加入50 mL 终止液；
读数：用酶标仪在双波长450 / 630 nm测定每孔OD值，分析软件分析数据。
针对不同条件下产生的标准曲线，选择能够满足要求的抗原抗体工作浓度。曲线要求零标准的OD值在2.200 - 2.500范围内，线性要求大于0.99，B点结合率介于75%-90%之间，拐点≤2；IC50介于中间标准品内。
3.3注意事项
3.1 将所需试剂从冷藏环境中取出，待其*回升至室温（20～25 ℃）后方可使用。注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
3.2 洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3.3 反应终止液为硫酸，避免接触皮肤。
3.4 生产定量标准
3.4.1 溶液配置体积按照入库数量配置，避免浪费；
3.4.2 零标准的OD值入库时控制在2.200-2.500；
3.4.3 标准曲线线性要求大于0.99；
3.4.4 标准曲线的拐点≤2；
3.4.5 IC50值介于中间标准品内；
3.4.6 B点结合率介于75%-90%之间。
3.5 生产定量要求
3.5.1 入库分装用的试剂配制好后，避免直接使用原瓶试剂，特别是需要多次使用的溶液，应分装出需要体积两倍的溶液单独使用，避免分装用原瓶试剂污染。
3.5.2 配置酶标物的试剂瓶应采用灭菌过的试剂瓶，其余试剂组分不需要采用灭菌试剂瓶。
3.5.3 配置用溶液无论体积多少，使用前均需检查外观是否浑浊或污染，然后再配制半成品溶液。
3.5.4 每生产一批及时填写生产定量批记录表（如下表），由生产部负责备档以便后期追踪审查。
一、 生产检验
1．指标要求
食品安全ELISA试剂盒入库前需满足的指标要求如下：
1.1 零标准的OD值入库时控制在2.200-2.500；
1. 2 标准曲线线性要求大于0.99、拐点≤2 、B点结合率介于75%-90%之间；
1. 3 IC50值介于中间标准品内；
1.4 阴性样本背景值≤检测限；
1.5 加标回收率介于70%-130%之间。
2. 检验
2.1生产定量后由生产负责人按照规定的检验指标进行*次检验，并填写试剂盒入库检验报告单，各指标符合要求后转交质控负责人进行复核检验，并填写试剂盒入库检验报告单（如下表）。
2.2 质控合格的由质控负责人签字生产检验单，告知生产部门及时入库。
2.3 生产检验单由质控负责人负责备档以便后期追踪审查。
二、 产品包装
1. 生产部按照要求将检验合格的产品及时分装入库，各试剂核对无误，方可分装；分装时要求环境洁净，分装人需带一次性口罩，分装不同液体使要及时更换枪头并且要慢吸防止倒吸，造成交叉污染。
2. 及时填好生产包装批记录表（如下表），由生产部负责备档以便后期追踪审查。
四、产品质控
1. 半成品管理
1.1 半成品要妥善保存，注明名称，日期，负责人名字，再次使用前检查外观是否浑浊或污染，确认无误后方可使用。
1.2 对放置超过3个月的以及外观不正常的试剂及时清理。
2. 成品管理
2.1 试剂盒分装后，留出一盒48T放置留样库，其余放置成品库。
2.2 由质控负责人按照入库时间计时，隔半月、1.5月、3月、6月及时进行质控，查看标准曲线情况，并填写检测试剂盒质控明细表（如下表），对不符合要求的试剂盒及时通知生产部门解决。
2.3 库存超过三个月的试剂盒根据质控情况更换批次或者更换关键试剂，重新入库，由生产部负责管理，对整改入库的试剂盒及时填写整顿单，由生产部负责备档以便后期追踪审查。
2.4质控报告模板统一，每批次试剂盒的质控曲线，一定注明单位（一般为ppb），采用清晰的截图方式，例如下图所示。
2.5 每个试剂盒均附有一份质控报告，质控报告由质控负责人签字后方可装入试剂盒。
五、发货管理
1. 报单记录
销售人员在明确客户名称、地址、产品、规格、单价、数量等信息后，及时记录报货明细，核对明细后详尽地填制到《发货申请单》上；然后通过、传真、网络等方式报单至相应部门负责人。
2. 销售合同
根据客户需求制作销售合同（如下图），双方达成一致后，待客户按照账户汇款成功后，试剂盒发货相应部门进行备货、制单、发货。
3. 制单
相关部门根据《发货申请单》，编制《发货单》。“发货单”为五联单，即存根联、记账联、出库联、客户联和回单联。*联“存根联”留存，其它四联全部交由销售人员分别送至物流部门及销售会计，进行组织发货及销售台账记账。其中：销售会计接收一联（计账联），物流部门接收其中的三联单据（出库联、客户联及回单联），即：
第二联“记账联”——销售会计接收，用于销售台账的记账及留存。
第三联“出库联”——用于部门内部出库及留存；
第四联“客户联”——随货同行，客户验收货物后签收留存；
第五联“回单联”——随货同行，客户验收货物后签字盖章，留待业务员回收、记账后上交营销中心转销售会计上账后留存；
4. 收单、记录、上账
销售业务人员必须按规定，在60天内将发货单的“回单联”从客户手中回收，回收的“回单联”必须有客户的签收确认（签名/盖章）及业务员签字。若有特殊情况（如回单丢失、金额不符等），则必须由客户出具相关证明材料，注明金额等详情，并签字/盖章，寄回或由业务员带回公司，进行审批、上账。若无客户的证明材料，则由责任业务员在公司财务留存的“送货单（记账联）”上签字确认，承担该批货物的完整接收责任。