共聚焦实验中培养耗材的选择

激光共聚焦显微镜可以观察到细胞内已经标记好的蛋白质和分子，为生物学研究提供了更直观的观测方法。如今，激光共聚焦成像已经是一个非常常规的实验操作，应用于生物学各个研究领域中。在细胞实验中，如果要进行一次激光共聚焦成像，除了要知道相关的显微镜参数设置和操作以外，样品的准备也是非常重要的一环。

爬片的使用

由于激光共聚焦实验对观测耗材的底部有着比较高的要求，普通的培养皿，培养板或者培养瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。

1.比较常用的是使用170μm左右厚度的盖玻片作为激光共聚焦成像的细胞载体。但是使用盖玻片，在实验操作上是非常麻烦的，有时候需要将盖玻片清洗并且烘干灭菌，才能开始使用。2.细胞爬片，虽然不需要清洗，但是还是需要进行包被才能让细胞正常贴壁生长。通常是将处理好爬片直接放在多孔板中，然后铺细胞，荧光染色后，再用镊子将爬片拿出，反过来放在滴有封片剂（甘油配置）的载玻片上，再进行成像。如图一所示：

图一：使用盖玻片和细胞爬片的做免疫荧光方法示意图。

玻底培养皿/板的使用方法

这里要介绍的方法，大大简化了样品准备流程，需要用到专为共聚焦实验设计的共聚焦培养皿。共聚焦培养皿的底部为0.16-0.19mm的硼硅酸盐玻璃，结合了标准培养皿/板的便利性和盖玻片的成像优势，可提供高倍放大显微镜及共聚焦图像分析所需的最佳光学特性。

所有的操作都在培养皿中进行，不再需要镊子以及繁琐的清洗，灭菌，包被程序（流程如图二所示）

图二：共聚焦专用培养皿的准备样品流程，可以直接进行细胞培养－染色－成像操作

操作流程

1. 在超净台中打开共聚焦专用培养皿的灭菌包装，拿出培养皿，加入细胞悬液，盖上皿盖，放入培养箱中静置，等待细胞贴壁。常规细胞培养，待细胞长置合适密度再取出，进行免疫荧光染色。

2. 吸出培养基，以PBS清洗细胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定细胞。

3. 20分钟后，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100

4. 10分钟后，吸出Triton，清洗细胞后加入BSA封闭。

5. 加入抗体荧光染色后，吸出所有试剂，加入封片剂，可以开始共聚焦显微成像。

使用共聚焦培养皿还有个好处：往往一个共聚焦扫描成像持续时间很长，培养皿中的液体非常容易挥发，共聚焦培养皿有皿盖，可以减少挥发。