昆虫细胞的保存培养实验

1. 将 3 ml 含 10％ 胎牛血清的昆虫细胞培养基 TNM-FH 加入到一个 60 mm 组织培养皿或 25 cm2 培养瓶中。

2. 取出一支冻存 Sf 9 细胞的安瓿，迅速置于 37℃ 水浴，用手前后摇动融化。当安瓿的内容物几乎融化时，将安瓿浸入 70％ 乙醇，消毒外壁。

3. 打碎安瓿颈部，将内容物转移至步骤 1 的 60 组织培养皿或 25 cm2 培养瓶。用手轻轻摇动，使细胞分散均匀，置 27℃ 温育 2～3 h 直到细胞贴壁。

4. 除去旧培养液，换 3 ml 新鲜培养液 TNM-FH/10％FBS，继续温育。每 3 天换液一次（除去旧培养液换新鲜的），直到细胞生长汇片（形成拥挤的单层培养物）。

5. 当 Sf 9 细胞已生长汇片时，弃去培养瓶中的培养液。加入新鲜的培养液，用移 液管轻柔吹打重悬细胞。

6. 用为培养组织细胞设计的血细胞计数器计数细胞。在血细胞计数器小方格上的每一个细胞相当于 104 细胞/ml。

7. 在一个新的 60 mm 组织培养皿或 25 cm2 培养瓶中接种来自步骤 5 的（1～2）× 106 个细胞，摇动培养瓶使细胞均匀分布（如果制备大量培养细胞，可用大的培养瓶，装入更多的培养液）。加入新鲜培养液 TNM-FH/ 10％ FBS 至终体积 3 ml。

8. 27℃ 温育，每 3 天用 TNM-FH/10％ FBS 培养基换液，直到培养瓶中的细胞生长汇片。

9. 弃去汇片的单层培养细胞中的培养液，并重悬细胞（同步骤 5），用血细胞计数器计数细胞。

10. 以（4～5）× 105 细胞/ml 的密度将细胞接种于一个旋转培养瓶中，27℃ 温育，以 60～80 r/min 的速度恒速搅拌。轻微开启旁边的通气孔，以保证充足的空气。

11. 每隔 2 或 3 天进行细胞计数（见附录 3F）。当细胞密度达到（2～2.5）× 105 /ml 时 进行传代，将适量细胞移至一个含有新鲜培养液 TNM-FH/10％ FBS 的新培养瓶中，使终密度达到（4～5）× 105/ml。

12. 在 1 ml 对数生长的细胞中加入 0.1 ml 的 0.4％ 台盼蓝，测定细胞活力。在低倍显 微镜下检查细胞，计数被台盼蓝染色的细胞（死细胞）和总细胞数，计算出死细胞和活细胞的百分比例。

13. 将单层培养细胞（从步骤 5）或悬浮培养细胞（从步骤 11）传代至由 1 份 TNM-FH/10％FBS 培养液和 1 份无血清培养液（Bacu 10 Gold，Sf-900 II 或 ExCell 401）组成的混合培养液中。让细胞长至汇片（单层培养），或达到（2～3）× 106 细胞/ml 的密度（悬浮培养）。

14. 按步骤 13 的方法重复，将细胞传代至 TNM-FH/10％FBS 培养液与无血清培养液比例为 1 : 3 的混合培养液中，使细胞生长。

15. 按步骤 13 的方法，用培养液与无血清培养液比例为 1: 7 至 1 : 9 的混合培养液，重复细胞传代与细胞生长的步骤。

16. 用无血清培养液传代细胞。

17. 计数呈对数生长的待冻存细胞（见附录 3F）。

18. 室温以 1000 g（GH-3.7 转子为 2000r/min）离心 10 min， 弃去上清液。

19. 用 TNM-FH/10％ FBS 培养液以（1～2）× 107 细胞/ml 的密度重悬细胞团块。加入等体积含 20％ DMSO 的 TNM-FH/10％ FBS 培养液，将细胞置于冰浴。吸出 1 ml 细胞悬液，移入带螺口盖的冻存管中，置于 -20℃ 1 h，然后 -70℃ 过夜。

20. 将冻结的细胞移至液氮罐中以便长期保存。