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水质  蛔虫卵的测定  沉淀集卵法

蛔虫卵测定适用范围：

本标准规定了测定水中蛔虫卵的沉淀集卵法。 

本校准适用于地表水和废水中的蛔虫卵测定。

当取样体积为10L时，本方法的检出限为5个/10L（注：不锈钢开口直壁容器应选择10L带刻度）

规范性引用文件

本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。

HJ/T 91地表水和污水检测技术规范

方法原理：

沉淀集卵法主要通过样品的浓缩、杂质分离、镜检计数等环节对水中的蛔虫卵进行测定。用60目全不锈钢筛网过滤去除样品中交大的杂质，利用蛔虫卵比重大于水和易于沉淀的特性过夜沉淀浓缩水样，用虹吸的放大弃去上清液，用表面活性剂吐温80作为残液及沉淀转移时的清洗剂，进一步离心浓缩转移的剩余物，收集到的浓缩物用乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，控制溶液PH值，获得亲水-亲脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪类杂质，使蛔虫卵更容易下沉。再次离心浓缩样品并弃去上部脂肪杂质层级缓冲液层，获得的含卵沉淀层用饱和硝酸钠溶液混匀，于计数框中静置漂浮后镜检，即可测得水样中蛔虫卵的数量。

配套试剂和材料：

      分析时请使用符合国家标准的分析纯化学试剂，试验用水为新制备的蒸馏水或者去离子水。

一：乙酸乙酯（C4H8O2）       

二：乙酸-乙酸钠缓冲液：PH=4.5

称取15.0g三水合乙酸钠(CH3COONa3H2O) ，溶于约800 ml实验用水中，加入3.6 ml乙酸(CH;COOH)调节pH值至4.5， 用实验用水定容至1000 ml。此溶液保质期为30d。

三：吐温80溶液: q (C24H4O6) =1 %o。

      移取1ml吐温80(Tween80)，用实验用水稀释定容至1000ml,临用现配。

四：饱和硝酸钠(NaNO3) 溶液

      称取略多于实验环境温度对应溶解度的硝酸钠(NaNO3),充分溶解于100g实验用水中，用滤纸滤去残渣，临用现配。硝酸钠在不同温度下的溶解度见附录A。

配套仪器和耗材：

      分析时如有量器请使用符合国家标准的A级量器

一：显微镜：物镜4x、10倍，目镜10x倍

二：冰箱：0℃-4℃

三：水平转子离心机：带50ml螺口尖底离心管，离心力1000g以上

四：漩涡混合器

五：筛网：60目 ，孔径250um 

六：不锈钢开口直壁容器10L（带刻度

七：开口直壁量筒：1000ml   A级

八：虹吸管

九：洗瓶

十：螺口尖底离心管50ml

十一：一次性巴氏滴管3ml、10ml

十二：微移液器：1000ul

十三：定量计数框：1ml网格、5ml型

样品：

按HJ/T 91中对一般污染物采样的要求，用10 L以上容积的塑料桶采样。采样前需用样品荡洗塑料桶，采集样品量应≥10L,常温下运回实验室，立即进行过滤(7.1)和沉淀(7.2)。

分析步骤：

一：过滤

      充分摇匀样品，转入不锈钢开口直壁容器至10L刻度。如样品中含有草梗、纸渣等较大杂质，需将样品用筛网过滤，并用吐温80溶液清洗筛网及杂质，洗液并入过滤后的10L样品中。

二：沉淀

      上述样品在15 C~25 C室温下静置过夜沉淀12 h~24 h,用虹吸管小心吸取并弃去上清液，避免扰动，保留1 L含沉淀物的样品，转入1000 ml开口直壁量筒，分别用50 ml吐温80溶液*清洗不锈钢开口直壁容器3次，洗液并入开口直壁量筒。在15 C~25 C室温下再次静置过夜沉淀12h~24h,用虹吸管吸取并弃去上清液，避免扰动，保留90 ml~ 100 ml含沉淀物的样品。

      注1:若样品中蛔虫卵浓度在10倍检出限以上(>50个/10L),采样时，可只采总量不小于1L的样品，取1L水样直接进行第二步的量筒沉淀浓缩。当样品中含有草梗、纸渣等较大杂质，同样应先将样品用筛网过滤，并用吐温80溶液清洗筛网及杂质，洗液并入1 L样品中沉淀。

离心：

沉淀浓缩后的样品(7.2) 小心转移至3个螺口尖底离心管，分别用15 ml 吐温80溶液*清洗开口直壁量筒3次，洗液均匀并入3个螺口尖底离心管。以1000g 的离心力(离心机转速计算见附录A)离心15 min,用巴氏滴管小心吸取并弃去，上清液，少量留之，避免带出沉淀。

      用少量吐温80溶液将3个离心管中的沉淀进行悬浮，将沉淀量少的2个离心管中的悬浮液并入沉淀量多的一个离心管中:分别用3 ml~ 5 ml吐温80溶液*清洗被转移悬浮液的2个离心管，每支清洗3次，确保没有沉淀被丢弃，洗液并入沉淀量多的离心管。以1000g的离心力离心15min, 用巴氏滴管小心吸取并弃去上清液，少量留之，避免带出沉淀。

脂类杂质分离去除：

用与离心后沉淀等体积的乙酸-乙酸钠缓冲液对沉淀进行悬浮(即:离心后沉淀体积为2 ml,加入2ml缓冲液。如果离心后沉淀体积不足2ml,加入缓冲液至4 ml。以确保用乙酸乙酯浸提后，沉淀上方有足够体积的缓冲液，便于脂类杂质层*倾出，且避免蛔虫卵沉淀层的丢失。

      加入2倍离心后沉淀体积的乙酸乙酯，用涡旋混匀器*混合。以.1000g的离心力离心15 min， 样品被分为清晰的三层。所有的非脂肪物质、重碎片，包括蛔虫卵、幼虫和原生动物在底层;中间层是缓冲液层;脂肪和其他脂溶性物质在上方形成黑而厚的一层。

      将上层和中间层液体平稳倾出弃去，记录底层沉淀体积。如有必要，可用细针在离心管壁四周对上层的脂肪层进行松动。

镜检：

加入5倍底层沉淀(7.4)体积的饱和硝酸钠溶液，对分离去除脂类杂质后的含卵底层沉淀进行悬浮。该悬浮液可置于0 C~4 C冰箱冷藏保存，备检，于1周内检测完毕，检测时需将其静置至室温。充分摇匀悬浮液，将其转入定量计数框静置5 min,在显微镜下计数，直至全部悬浮液镜检完成。分别用1 ml饱和硝酸钠溶液充分洗涤镜检完的离心管3次，将洗液转入定量计数框，按以上步骤镜检。所有检测到的蛔虫卵全部计数。

      镜检时，需保持环境条件的稳定，无震动和风扰，缓移计数框，自上而下“U”型逐列计数。蛔虫卵鉴定方法见附录B。

空白对照试验：

取10L同批次试验用水，按以上采样及分析步骤进行全程序样品的测定。

结果计算于表示：

计算结果：

C------水样中蛔虫卵浓度（个/10L）

N-----检测到的所有蛔虫卵数（个）

Q-----实际水样体积（10L）

结果表示：

      水质中蛔虫卵的测定，实验终结果取整数，以“个/10L”为单位

精密度：

6家实验室分别对实际样品和低浓度(20 个/10L)、中浓度(40 个/10L)、高浓度(80个/10L)自配样品的蛔虫卵进行测定，实验室内相对标准偏差范围分别为:6.5%~18.9%，10.1%~22.0%，12.8%~23.8%， 8.9%~ 17.4%;实验室间相对标准偏差分别为5.8%、5. 5%、4.9%、4.8%; 重复性限(个/10L)为244、3、7、11;再现性限(个/10L)为260、3、7、11。

质量保证和质量控制：

      每批次样品至少做1个全程序空白实验，并取10%的样品进行平行样测定，全程序空白实验不得检出蛔虫卵，平行样间的相对偏差不得超过30%。

废物处理：

      实验中虹吸液煮沸10min后可按普通废弃物处理，含乙酸乙酯的废弃液应集中保管，委托有资质的单位进行处理。

注意事项：

实验用过的器具均需进行高温灭活，置于水中煮沸10min后方可再次使用。

      实验操作人员要注意自身防护，试验时要穿戴工作服、乳胶手套、及口罩等，同时还要避免蛔虫卵的样品污染实验室环境。

附录A

硝酸钠水中溶解度、离心机离心力及转速计算公式

A.1  硝酸钠在水中的溶解度

表A.1   硝酸钠水中溶解度

A.2离心力计算公式：

附录B

蛔虫卵的检定

B.1蛔虫卵的形态特征

B.1.1受精蛔虫卵

      虫卵呈短椭圆形，大小为45 μm~75 μmx35 μm~ 50 μm。卵壳很厚，自外向内分为三层:受精膜、壳质层和蛔甙层，壳质层较厚，另两层极薄，在普通显微镜下难以分清。卵壳内有一个大而圆未分裂的受精卵细胞，与卵壳间常见有新月形空隙。卵壳外有一层由虫体子宫分泌形成的蛋白质膜，其表面凹凸不平呈波浪状。随粪便排出的虫卵常被胆汁染成黄色或棕褐色。

B.1.2未受精蛔虫卵

      虫卵呈长椭圆形或不规则形，大小为88 μm~94 μmx39 μm ~44 μm，卵壳与蛋自质膜均较受精蛔虫卵薄，淡黄色，无蛔甙层，卵壳内含有许多大小不一的屈光颗粒。

B.1.3感染期蛔虫卵

      卵内含有一.条卷曲的幼虫。

B.1.4蛋白质膜脱落的蛔虫卵

      若蛔虫卵的蛋白质膜脱落，卵壳则呈无色透明，应注意与其他线虫卵的鉴别。

B.2蛔虫卵参考图片

B.2.1蛔虫卵模式图

B.2.2发育各阶段的蛔虫卵

附录C

蛔虫卵配置样品的制备

猪蛔虫(Ascaris suum)活成虫采集自屠宰场，用蒸馏水洗涤干净后，放置于含4 %甲醛溶液内，0 C~4 C保存备用，可长期保存。

      制备蛔虫卵备用液时，选取2~3条雌性蛔虫，用75 %乙醇消毒过的解剖刀，划开虫体，每条蛔虫一- 对子宫选取靠近阴门的一段(2 mm~3 mm),解剖后，将含蛔虫卵的内容物及组织碎片放入50ml离心管中，加入数颗直径1mm玻璃珠及10ml生理盐水，混匀后于涡旋混匀器振荡3min~5min,用260目网过筛，取40ml生理盐水分数次冲洗离心管和筛网，此时获得的滤液中蛔虫卵呈单个状态存在。滤液加入甲醛至终浓度为4%，0 C~4 C保存备用，可保存1个月。即制即用时可不添加甲醛。

      制备配制样品时，摇匀蛔虫卵备用液，用1000 μ1微量移液器，立即吸取适量的蛔虫卵备用液于1ml定量计数框(网格)中，计数后用250μl微量移液器向计数框中添加或移出蛔虫卵至所需数量。将计数框中所有的液体用吐温80溶液冲洗入配制样品中。再在显微镜下检测计数框，确保无蛔虫卵残留。