组织结构型内皮细胞一氧化氮合成酶（cNOS/NOS3/eNOS）活性荧光定量检测

试剂盒产品说明书

主要用途

组织结构型内皮细胞一氧化氮合成酶（cNOS/NOS3/eNOS）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过一氧化氮合成酶反应系统，在内皮细胞一氧化氮合成酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，由底物L-精氨酸被催化产生一氧化氮，进而与荧光探针二氨基荧光素反应，生成强烈荧光产物三唑并荧光素，通过其相对荧光峰值的变化，即采用荧光法来测定样品中结构型内皮细胞一氧化氮合成酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）的结构型内皮细胞一氧化氮合成酶的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，重复性好。

技术背景

一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase；NOS；EC1.14.13.39）是钙调蛋白（calmodulin）依赖性或含钙调蛋白的细胞色素p450类血红素蛋白（hemoprotein），分子量为130至160KD的二体蛋白，其催化结构域包括还原酶、加氧酶、黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide；FAD）、核黄素单苷酸（flavin mononucleotide；FMN）等要素，在辅助因子四氢生物喋呤（tetrahydro-biopterin）的帮助下，进行非芳香类氨基酸L-精氨酸（L-arginine）的5’端电子氧化。一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端的氮原子，在还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）和氧气的参与下，成为一氧化氮（nitric oxide）的合成反应。一氧化氮合成酶有三种异构体：神经元型（neuronal NOS；nNOS；）、内皮细胞型（endothelial NOS；eNOS；NOS3）和巨噬细胞型（macrophage NOS；mNOS；NOS2），前二者为结构型一氧化氮合成酶（constitutive NOS；cNOS），后者为诱导型一氧化氮合成酶（inducible NOS；iNOS）。其中内皮细胞型（eNOS）为膜相关性蛋白（豆蔻酰化；myristoylation），分布在心血管以及脑血管组织，含有N-末端加氧酶、C-末端还原酶和钙调蛋白结合结构域，其功能在于作为血管保护分子，维持血管紧张度（vascular tone）和完整性，同时受到钙离子、钙调蛋白、磷酸化等调节。基于底物L-精氨酸，在eNOS敏感性抑制剂亚胺乙基鸟氨酸（L-N⁵(1-iminoethyl)- L-ornithine；L-NIO）存在与否的情况下，通过NADPH和氧气的参与，由一氧化氮合成酶催化产生一氧化氮气体和瓜氨酸（citrulline）；进而使用特异性荧光探针二氨基荧光素（4,5-diaminofluorescein；DAF-2）与一氧化氮反应，生成强烈荧光产物三唑并荧光素（triazolofluorescein；DAF-2T），通过其相对荧光峰值的变化（激发波长495nm，散发波长515nm），来定量分析结构型内皮细胞一氧化氮合成酶的特异活性。其反应方式为： 

eNOS

L-arginine  +  NADPH  +  O2   →   nitric oxide  +  citrulline  +  NADP

L-NIO

DAF-2  +  NO +  O2  →  DAF-2T

产品内容

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  20毫升

缓冲液（Reagent C）   5毫升

反应液（Reagent D）   1毫升

显色液（Reagent E）   250微升

标准液（Reagent F） 100微升

专性液（Reagent G） 100微升

产品说明书      1份

保存方式

保存反应液（Reagent D）、显色液（Reagent E）、标准液（Reagent F）和专性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 显色液（Reagent E）和标准液（Reagent F）避免光照；有效保证6月

用户自备

*缓冲液（Reagent H）：用于检测纯化内皮细胞型一氧化氮合成酶或体外检测

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于制备样品和标准品的容器

（微型）台式离心机：用于样品处理

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织样品

恒温水槽：用于反应孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于样品荧光分析

实验步骤

一、样品准备

• 手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗
• （选择步骤）抽去清理液
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入1毫升裂解液（Reagent B）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用研磨棒匀化（约80下）
• 将所有匀浆物移入2毫升离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取1毫升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作