污染向来是在细胞培养中的大问题。预防或治理污染是细胞培养成功的关键因素。我们在细胞培养时，在开始阶段就要十分重视污染问题，否则会前功尽弃，这样不仅浪费时间，也会浪费人力、物力。  

(一)  有哪几类污染？

在细胞培养过程中的污染不只是指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。   

1、细菌污染

细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，后变圆脱落死亡。   

2、真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中见的一种，的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

3、支原体污染

支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的小微生物，小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。  

培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。   

4、非同种细胞污染

由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。   细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不*而带入一些有毒化学物质所致。

（二）污染类型的区别

1、细菌、真菌污染的检测

(1)  肉眼观察 ---- 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。  

(2)  接种观察 ---- 用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。   

(3)  镜下观察 ---- 倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。   

2、支原体污染的检测

(1)  相差显微镜观察 ---- 接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。  

(2)  荧光染色法观察 ---- 荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。  

(3)  电镜检测 ---- 条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。  

(4)  培养检测 ---- 细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。  

3、病毒的检测

(1)  应用电镜技术快速诊断动物病毒病  

(2)  逆转录_聚合酶链反应RT_PCR检测病毒