各种动物外周血中性粒细胞分离液试剂盒

规格： 200 mL/kit

保存： 本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期 2 年。无菌开封后，保存于室温。

产品组成：

操作步骤：(仅供参考)

客户可依据血液样本量大小，选择适宜的分离方式：

分离方案一

1. 新鲜抗凝全血用 1XPBS 按 1:1 稀释，在离心管中先加入 4mL 试剂 A，后将 2mL 试剂 C 沿管壁缓慢滴加（建议使用巴氏吸管并 45°倾斜试管）于试剂 A 之上，形成梯度界面，将悬液小心平铺于分离液液面上方。注意分离液与样本总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果。

2. 室温条件下水平转子 600-1000g，25-30minutes（血液体积越大所需离心力越大，离心时间越长，最佳分离条件需摸索，离心最大转速不超过 1000g）。

3. 离心后，上层白膜层为单个核细胞层，下层白膜层为粒细胞层（受个体差异及分离条件影响，粒细胞层可能会存在不同程度的红细胞污染）。

4. 吸取粒细胞层及其上方 1ml 左右分离液至新的离心管中，加入 10mL 细胞洗涤液洗涤细胞。250g，离心 10min（如有红细胞污染可依据样本体积加入适量红细胞裂解液祛除污染）。

5. 弃上清，加入 10mL 细胞清洗液重悬细胞，250g，离心 10min。

6. 弃上清，重悬细胞备用。

分离方案二

1. 沉降去除红细胞：取新鲜抗凝血与血液稀释液（注射用生理盐水或 1XPBS）及红细胞沉降液按照 1:1:1 比例混匀，室温下静置 30-40min 后，可见红细胞沉于试管底部，小心吸尽上清层（富含白细胞及血小板）用于后续细胞分离。

2. 样本分离：在 15mL 离心管中先加入 4mL 试剂 A，后将 2mL 试剂 C 沿管壁缓慢叠加（45°倾斜试管）于试剂 A 之上，形成梯度界面，将悬液小心平铺于分离液液面上方。

3. 离心后，上层白膜层为单个核细胞层，下层白膜层为粒细胞层（受个体差异及分离条件影响，粒细胞白膜层可能会出现颜色较浅的情况）。

4. 吸取粒细胞层及其上方 1ml 左右分离液至新的离心管中，加入 10mL 细胞洗涤液洗涤细胞。250g，离心 10min（如有红细胞污染可依据样本体积加入适量红细胞裂解液祛除污染）。

5. 弃上清，加入 10mL 细胞清洗液重悬细胞，250g，离心 10min。

6. 弃上清，重悬细胞备用。

注意事项：

A. 开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。

B. 分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层不清晰。

C. 血液样本最好为新鲜抗凝血（采血 2h 以内），为保持中性粒细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。

D. 稀释血液或洗涤细胞，不可使用含 Ca、Mg 离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。

E. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。

F. 血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件。

G. 如果要进一步对分离的细胞进行培养，注意全程保持无菌操作，避免微生物污染。

H. 不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。