精子DNA吖啶橙（acridine orange）荧光检测试剂盒产品说明书

主要用途

精子DNA吖啶橙（acridine orange）荧光检测试剂是一种旨在使用吖啶橙染料使单链和双链DNA呈现不同荧光，确定精子染色质质量或DNA损伤的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种动物或人体精子细胞以及冻存精子细胞。产品严格无菌，即到即用，操作简便，性能稳定，荧光清晰。

技术背景

在男科学（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子寿命、以及生育能力的基础信息。其中精子的活力（vitality）、运动能力（motility）、授精潜力（fertilizing potential）、膜结构或染色质结构完整性（integrity）、顶体反应（acrosomal reaction）功能的评价是精子分析的重要指标，也是决定人工受孕或体外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要参数。精子DNA损伤或染色质质量是不育症的主要因素之一。使用阳离子三环胺荧光染料吖啶橙（Acridine orange；AO）染色技术，是精子染色质分析和授精效率评价的常用的方法。基于正常精子细胞的染色质完整性和DNA双链特性，作为DNA染色剂之一的吖啶橙与正常非变性DNA，即双链DNA嵌合（intercalate）时，呈现绿色荧光（激发波长488nm，散发波长530nm）；而与变性DNA，即单链DNA结合时，呈现红色荧光（激发波长488nm，散发波长630nm），以此定量分析精子质量或DNA损伤。 

产品内容

清理液（Reagent A）                                      毫升
固着液（Reagent B）                                      毫升
染色液（Reagent C）                                      毫升
产品说明书                                                    1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent C）避免光照，有效保证6月
  
用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
微型台式离心机：用于样品操作
血细胞计数器：用于细胞计数
载玻片和盖玻片：用于精子细胞爬片
（共聚焦）荧光显微镜：用于观察染色的精子细胞
细胞流式仪：用于分析染色的精子细胞

实验步骤

一、细胞流式仪分析

1．移取新鲜获得的1毫升精液（30分钟至1小时内）到1.5毫升离心管
2．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g 
3．小心抽去上清液
4．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀颗粒群
5．在血细胞计数器上进行精子细胞计数：1 × 107精子细胞/毫升
6．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g 
7．小心抽去上清液
8．重复实验步骤4至7一次（不包括实验步骤5）
9．加入xx微升染色液（Reagent B），混匀颗粒群
10．室温下孵育10分钟，避免光照
11．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g 
12．小心抽去上清液
13．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀颗粒群
14．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g 
15．小心抽去上清液
16．重复实验步骤13至15一次
17．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀颗粒群
18．即刻进行细胞流式仪双通道分析：观察10000个细胞以上，200细胞/秒；激发波长200mW，散发波长16 mW

激发波长    488nm    488nm
匹配荧光染料    异硫氰酸荧光素（FITC）    藻红蛋白（phycoerythrin；PE）
荧光颜色    绿色    红色
散发波长    530    630
流式仪通道    FL1    FL3
荧光增强    正常精子DNA    异常精子DNA
19．细胞流式仪检测正常精子DNA（双链DNA）参考图像如下（X轴：FL3；Y轴：FL1；R1左下角为细胞碎屑；R2为正常精子细胞；R3为异常精子细胞；R4为未成熟精子细胞）

二、荧光显微镜分析

1．移取新鲜获得的1毫升精液（30分钟至1小时内）到1.5毫升离心管
2．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g 
3．小心抽去上清液
4．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀颗粒群
5．在血细胞计数器上进行精子细胞计数：1 × 107精子细胞/毫升
6．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g 
7．小心抽去上清液
8．重复实验步骤4至7一次（不包括实验步骤5）
9．加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀颗粒群
10．即刻移取20微升到洁净的载玻片一端
11．用盖玻片或另一个载玻片推片
12．置于空气中凉干
13．加上xx微升固着液（Reagent B），覆盖样品表面
14．室温下孵育2小时
15．小心抽去固着液
16．小心加上xx微升染色液（Reagent C），覆盖样品表面
17．室温下孵育5分钟，避免光照
18．小心抽去染色液
19．小心加上xx微升清理液（Reagent A），覆盖样品表面
20．小心抽去清理液
21．盖上盖玻片
22．即刻在（共聚焦）荧光显微镜下观察并计数（注意：每个视野计数200个精子）
23．分析结果（参考图）
观察红色荧光：滤波器激发波长488nm，散发波长630nm ――可见黄色、桔红色至红色荧光，表明精子
DNA损伤包括单链DNA

观察绿色荧光：滤波器激发波长490nm，散发波长530nm ――可见绿色荧光，表明精子DNA正常 

注意事项

1．本产品为50次操作
2．操作时须戴手套
3．样品检测前，建议在血细胞计数器上进行精子细胞计数
4．精子细胞计数时乘上稀释倍数104。标准血细胞计数器（Hemocytometer）的计算方法是：
1毫米方块的细胞计数X 104（稀释倍数）＝实际细胞数/毫升
5．染色完成后，即刻进行检测分析，否则由于其毒性导致精子DNA异常
6．如果流式细胞仪出现干扰，建议使用630nm散发波长，或进行补偿处理，建议使用诱导处理样品：10单位DNase I/毫升37℃孵育10分钟或直接70℃孵育30分钟
7．本产品常用于冻存精子细胞的检测分析
8．本产品可以用于精子染色质结构分析（Sperm Chromatin Structure Assay；SCSA），分析参数如下：

    %DFI    %HDS
名词解释    DNA断裂指数
DNA Fragmentation Index    DNA着色程度
High DNA Stainability
相同命名    COMP αt    HIGRN
计算方法    红色荧光：红色＋绿色荧光之比    高亮绿色荧光
参考值    正常人：小于15％    正常人：小于10％
    阈值：小于30％    阈值：小于15％
    高生育力：0－15％    
    中等生育力：16－27％    
    低或差生育力：27－30％    
参数意义    DNA损伤程度    精子成熟程度

9．本公司提供系列发育生物学相关检测试剂产品
 
质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定荧光清晰