脂肪酸β氧化速率比色法检测试剂盒产品说明书

主要用途

脂肪酸β氧化速率（β oxidation rate）比色法检测试剂是一种旨在通过棕榈酰肉碱氧化依赖性铁氰化物还原，即单位时间还原产物的峰值降低，即采用比色法来测定线粒体裂解样品中脂肪酸β氧化速率的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞、组织中线粒体裂解悬液样品（动物、人体等）脂肪酸β氧化速率的检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β氧化及后经三羧酸循环被*氧化生成CO2和H2O，并释放能量等四个阶段，是体内，尤其是组织器官，例如肝脏、心脏和骨骼肌等能量内平衡的关键代谢通路。食物中甘油三酯提供体内三分之一的能量供给，骨骼肌和心脏消耗80%的总能量。脂肪酸代谢异常，将导致脂质聚集在非脂肪组织内，产生慢性病的病理基础，例如糖尿病、心衰、肥胖症等。其中β氧化，包括脱氢、水合、二次脱氢和硫解，是将活化的各种长度脂酰辅酶酯（acyl CoA esters）不断缩短为乙酰辅酶A（acetyl CoA）单位，后经过三羧酸循环和呼吸链氧化成CO2和水。脂酰基辅酶A脱氢酶（acyl CoA dehydrogenase；AD；EC.1.3.99.3）是脂肪酸代谢进入β-氧化后工作的重要酶之一。通过底物棕榈酰肉碱（palmitoyl carnitine）的氧化产生的电子，由铁氰化物（ferricyanide）捕获而还原，其还原速率的检测，来评价β氧化的速率，即吸光值（420nm波长）的下降与时间的对应关系。

产品内容

缓冲液（Reagent A）  20毫升

反应液（Reagent B）   2毫升

底物液A（Reagent C）   1毫升

底物液B（Reagent D）   1毫升

阴性液（Reagent E）     1毫升

产品说明书      1份

保存方式

保存反应液（Reagent B）、底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于反应操作的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如纯化线粒体），至于冰槽里备用
• 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长420nm和470nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照
• 缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取750微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反应液（Reagent B）
• 加入50微升底物液A（Reagent C）
• 加入50微升底物液B（Reagent D）

• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升阴性液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照【（OD420—OD470）0分钟－（OD420—OD470）5分钟】

• 样品测定

• 移取750微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反应液（Reagent B）
• 加入50微升底物液A（Reagent C）
• 加入50微升底物液B（Reagent D）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（500微克线粒体蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数【（OD420—OD470）0分钟－（OD420—OD470）5分钟】 

四、计算氧化速率

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.5（样品质量；毫克）X 105（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝微摩尔铁氰化物还原/分钟/毫克

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要 
• 加样后3秒内比色测定
• 测定值由高到低变化；测定可持续5分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有氧化功能
• 建议待测样本线粒体蛋白浓度为500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感