胞浆内钙离子浓度荧光（Fura-2）检测试剂盒产品说明书

主要用途

胞浆内钙离子浓度荧光（Fura-2）检测试剂是一种旨在通过线粒体钙离子特异性荧光探针Fura-2-AM，与钙离子结合后，其荧光强度显著增强，在荧光分光光度仪下测量不同激发波长下相对荧光峰值的比值，来测定细胞浆总钙离子浓度的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞（动物、人体等）或冰冻切片组织细胞浆钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。

技术背景

钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。在细胞内，钙离子主要储存在线粒体和内质网等细胞器中。其中细胞浆钙离子在调节钙离子通道，维持细胞内环境钙离子平衡方面起着重要作用。细胞浆钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求，以及需要线粒体、细胞浆分离。Fura-2 AM（acetoxy-methyl ester），一种具有细胞膜通透性，与钙离子结合产生荧光的染料，通过其不同激发波长340nm/380nm产生的荧光信号比（散发波长510nm）来测定细胞浆内钙离子水平。 

产品内容

清理液（Reagent A）      40毫升

染色液（Reagent B） 30微升

介导液（Reagent C）     600微升

饱和液（Reagent D）       2毫升

阴性液（Reagent E）       2毫升

裂解液（Reagent F）     200微升

产品说明书     1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和介导液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器

细胞培养箱：用于染色孵育

96孔培养板：用于样品操作的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光染色观察

实验步骤

• 测定准备

• 设定好荧光酶标仪：激发波长340nm和380nm，散发波长510nm
• 测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）室温下融化，然后分别移出30微升介导液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，标记为染色工作液，并放在暗室里备用。然后进行下列操作。 

二、荧光酶标仪检测

• 准备1个96孔细胞培养板，标记为：细胞样品孔、空白对照孔（不含细胞）、大对照孔（含细胞）
• 小心抽去细胞样品孔的培养液
• 加入100微升清理液（Reagent A）到细胞样品孔里
• 加入100微升饱和液（Reagent D）到大对照孔里
• 加入100微升阴性液（Reagent E）到空白对照孔里
• 分别加入10微升染色工作液到所有孔里
• 轻轻摇动酶标板，混匀
• 放进37℃细胞培养箱里孵育60分钟，避免光照
• 小心抽去细胞样品孔里的上清液
• 小心加入100微升清理液（Reagent A）到细胞样品孔里
• 重复实验步骤9和10一次
• 放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟
• 加入5微升裂解液（Reagent F）到大对照孔里
• 放进37℃细胞培养箱里孵育15分钟
• 即刻放进荧光酶标仪测读：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU）包括样品RFU340nm、样品RFU380nm、空白对照孔RFU340nm、空白对照孔RFU380nm、大对照孔RFU340nm、大对照孔RFU380nm
• 计算样品细胞浆钙离子浓度

【（样品RFU340nm/样品RFU380nm）－（空白对照孔RFU340nm/空白对照孔RFU380nm）÷（大对照孔RFU340nm/大对照孔RFU380nm－样品RFU340nm/样品RFU380nm）】X（空白对照孔RFU380nm/大对照孔RFU380nm） X 140（纳摩尔；解离常数）

三、（共聚焦）或荧光显微镜检测

1． 准备1个待测的细胞爬片样品

• 小心加上500微升清理液（Reagent A），覆盖样品表面
• 小心移去样品上的清理液（Reagent A）
• 移取300微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管
• 加入30微升染色工作液，混匀 
• 小心加上上述含有染色工作液的溶液到样品上，覆盖样品表面
• 放进37℃细胞培养箱里孵育60分钟，避免光照
• 小心移去样品上的染色工作液
• 小心加上500微升新鲜的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升新鲜的清理液（Reagent A）
• 放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 盖上盖玻片
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长340至400nm，散发波长510nm（细胞浆钙离子呈现蓝色荧光）

四、冰冻切片检测

• 准备1个待测的冰冻切片
• 小心加上500微升清理液（Reagent A），覆盖切片样品表面
• 小心移去样品上的清理液（Reagent A）
• 移取300微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管
• 加入30微升染色工作液，混匀 
• 小心加上上述含有染色工作液的溶液到切片样品上，覆盖样品表面
• 放进37℃细胞培养箱里孵育60分钟，避免光照
• 小心移去切片上的染色工作液
• 小心加上500微升新鲜的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升新鲜的清理液（Reagent A）
• 放进37℃细胞培养箱里孵育30分钟
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 盖上盖玻片
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长340至400nm，散发波长510nm（组织细胞浆钙离子呈现蓝色荧光）

注意事项

• 本产品为20次（显微镜）或60次（酶标板）操作
• 操作时，须戴手套
• 可以使用荧光分光光度仪检测
• 如果细胞内酯酶缺失，则建议使用微注射（microinjection）技术
• 避免使用EDTA等处理样品
• 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 检测敏感度可达纳摩尔级钙浓度范围
• 本公司提供系列钙生化检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感