抗体亲和纯化系列
时间：2022-02-11 阅读：249
抗体亲和纯化系列
产品概述
Protein A、Protein G是常应用于抗体亲和纯化和免疫沉淀的蛋白。将Protein A、G分别固定在不同的介质上，或同时将Protein A、G共价偶联到介质表面，是从腹水、细胞培养物上清和血清中分离IgG和IgG亚家族的有效工具。
Protein L源于细菌，能更广泛地结合各种类型以及亚类的免疫球蛋白，包括所有类型的IgG和单链可变区(ScFv)以及Fab片段。该蛋白只与抗体的kappa链结合而不会影响抗体的抗原结合位点，这一特性使其与蛋白A或蛋白G相比，能更广泛地结合各种来源及亚类的抗体。
Yeasen生物提供一系列以蛋白A、蛋白G与蛋白L为核心的抗体纯化工具，涵盖不同类型填料树脂及自动层析预装柱，方便使用手动或自动化方式纯化抗体蛋白质。
Protein A、G、L的差异分析
Protein A | Protein G | Protein A/G | Protein L | |
优点 | 高流量； 结合能力强； 与IgG的Fc和Fab和F（ab’）2片段结合 | 比Protein A有结合范围更广泛 | 结合范围更广； 结合能力更强； 实用性更高 | 不仅可以结合所有的Ig类(IgG，IgM，IgA，IgE和IgD)； 还可以结合单个轻链（Scfv）和Fab片段 |
缺点 | 宿主细胞蛋白的一些非特异性结合 | 不能像蛋白A一样耐受苛刻的洗脱条件 | 不结合牛、山羊或绵羊来源的免疫球蛋白 |
附表1是关于蛋白A和蛋白G对于不同的免疫球蛋白相对结合力的比较，可用于预测蛋白A或蛋白G作为亲和介质时的选用指导。对于来自特别物种IgG的///佳结合条件，应该查阅近期的文献，获得有价值的信息。
纯化原理
亲和纯化是一种具有可逆反应的生化分离纯化技术，如抗原与抗体。适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。如图1所示，首先填料与介质偶联，结合形成具有特异亲和性的分离介质，再向柱子中注入样本，配体选择性的吸附目标物质，平衡液洗杂，终用洗脱液将目标物质进行洗脱。
图1 亲和层析示意图
产品性能
将蛋白样本Protein A和Protein G纯化IgG，IgG片段和亚类的基础是二者对IgG-类型的多克隆抗体和单克隆抗体具有很高的特异性亲和力。
图2 Protein A、G亲和性
纯化指南
Yeasen生物抗体纯化类工具，以基因改造后的Protein A/G、Protein L为原料，通过不同化学方法将其定向、的偶联到琼脂糖基质上，不仅降低了蛋白的非特异性结合、实现了树脂较高的抗体载量，同时也获得了适用于不同纯化要求的抗体纯化产品。
产品系列 | 普通型纯化树脂系列 | 快速型纯化树脂系列 | 预装柱系列 |
Protein A、G 、A/G、L Agarose | Protein A、G 、A/G、L 4FF Agarose | Protein A、G、L 4FF Chromatography Column | |
平均粒径d50V | 45-165µm | 90µm | 90µm |
配基 | 重组蛋白 | 重组耐碱蛋白 | 重组耐碱蛋白 |
载量 | Protein A > 40mg人IgG/mL Protein G > 30mg人IgG/mL Protein A/G > 20mg人IgG/mL Protein L > 15mg人IgG/mL | Protein A > 40mg人IgG/mL Protein G > 30mg人IgG/mL Protein A/G > 20mg人IgG/Ml Protein L > 15mg人IgG/mL | Protein A > 40mg人IgG/mL Protein G > 30mg人IgG/mL Protein A/G > 20mg人IgG/mL Protein L > 30mg人IgG/mL |
大操作压力 | 0.1MPa,1bar | 0.3MPa,3bar | 0.3MPa,3bar |
支撑物 | 4%琼脂糖微球 | 高度交联4%琼脂糖微球 | 高度交联4%琼脂糖微球 |
优势 | 非特异性结合低，高载量 | 非特异性结合极低，高载量高流速，强稳定性 | 柱效稳定，高载量，高流速，强稳定性，标准接口适配商品化各类中压色谱系统 |
推荐应用 | 任意规模抗体纯化 | 任意规模抗体纯化，IP | 小规模抗体纯化 |
纯化实例
使用Protein A 1mL预装柱纯化鼠单抗IgG1，纯化效率高于95%。
图3 Protein A纯化结果示意图
FAQ
常见问题 | 原因分析 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 | 筛板堵塞 | 清洗或更换筛板 |
填料堵塞 | 参照说明书树脂清洗 | |
裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜 (0.22或0.45μm)过滤，或者离心去除 | ||
样品纯化过程中曲线不稳定 | 样品或Buffer中含气泡 | 去除样品或柱子中的气泡 |
样品和buffer进行脱气 | ||
洗脱组分中没有目的蛋白 | 样品中抗体浓度太低 | 适当提、高抗体浓度 |
抗体被降解 | 蛋白洗脱后应立即中和，适当提高洗脱液pH | |
样本与纯化介质柱不匹配 | 参照表1选择合适的纯化介质 | |
电泳loading buffer DTT失效 | 使用新鲜配制loading buffer | |
洗脱缓冲液pH不对 | 依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱，电泳检测产物 | |
结合缓冲液pH不对 | 应保证样本和结合缓冲液pH在7.0 | |
回收率逐渐降低 | 上样量过多 | 减少上样量 |
柱子太脏，载量降低 | 参照说明书进行树脂清洗 | |
样本中脂蛋白、酚红、小分子污染物等的去除 | 每毫升样品中加入0.04mL硫酸右旋葡糖酐和1mL 1M CaCl2沉淀脂蛋白，离心除去 | |
PVP加入样品中至终浓度为3%沉淀b-脂蛋白和球蛋白，离心去除 | ||
结合缓冲液稀释样本 | ||
脱盐柱除去酚红 | ||
分级沉淀法去除低分子污染物，可采用硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀等方法 | ||
抗体药物纯化过程中，降低聚集体含量 | 在上游细胞培养，控制///佳的收获时机，避免培养过程中抗体聚集 | |
低pH洗脱液中，加入保护剂（Arg等） | ||
低pH洗脱后，快速中和 | ||
适当降低亲和层析柱进样量 | ||
样品处理和纯化过程中，保持低温（4-8℃） | ||
订购信息
产品名称 | 货号 | 规格（mL） | 价格（元） |
蛋白A琼脂糖纯化树脂 | 36401ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 546/2186/7426 |
蛋白A琼脂糖快速纯化树脂 | 36402ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 866/2656/8856 |
蛋白A/G琼脂糖纯化树脂 | 36403ES03/05/08/25/60 | 1/2/5/25/100 | 278/538/878/2886/7426 |
蛋白A/G琼脂糖快速纯化树脂 | 36404ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 978/3186/8726 |
蛋白G琼脂糖纯化树脂 | 36405ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 546/2186/7426 |
蛋白G琼脂糖快速纯化树脂 | 36406ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 978/3186/8726 |
蛋白L琼脂糖纯化树脂 | 36407ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 2488/9988/16488 |
蛋白L琼脂糖快速纯化树脂 | 36408ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 2868/13288/27688 |
蛋白A纯化预装柱，1mL | 36409ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 528/2218 |
蛋白A纯化预装柱，5mL | 36410ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 1848/6838 |
蛋白G纯化预装柱，1mL | 36413ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 528/2218 |
蛋白G纯化预装柱，5mL | 36414ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 1848/6838 |
蛋白L纯化预装柱，1mL | 36415ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 938/3748 |
蛋白L纯化预装柱，5mL | 36416ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 3528/14088 |
蛋白A/G免疫沉淀磁珠 | 36417ES03/08 | 1/5 | 787/2937 |
参考文献
[1] Gao L, Guo Q, Li X, et al. MiR-873/PD-L1 axis regulates the stemness of breast cancer cells[J]. EBioMedicine, 2019, 41: 395-407.
[2] Jiang S, Liu Y, Shen Z, et al. Acetylome profiling reveals extensive involvement of lysine acetylation in the conversion of muscle to meat[J]. Journal of proteomics, 2019, 205: 103412.
[3] Zhang F, Ni H, Li X, et al. Lnc RNA FENDRR attenuates adriamycin resistance via suppressing MDR 1 expression through sponging HuR and miR‐184 in chronic myelogenous leukemia cells[J]. FEBS letters, 2019.
[4] Sun Z, Wang Z, Li L, et al. RAGE/galectin-3 yields intraplaque calcification transformation via sortilin[J]. Acta diabetologica, 2019, 56(4): 457-472.
附表:
附表1 蛋白A和蛋白G对不同免疫球蛋白的结合力
免疫球蛋白来源 | 亚类 | 蛋白A结合力 | 蛋白G结合力 |
人类Human | IgG | +++ | +++ |
IgG1 | ++++ | ++++ | |
IgG2 | ++++ | ++++ | |
IgG3 | - | +++ | |
IgG4 | ++++ | ++++ | |
IgA | 可变的 | - | |
IgA1 | + | - | |
IgA2 | + | - | |
IgD | - | - | |
IgE | ++ | - | |
IgM | + | - | |
兔Rabbit | IgG | +++ | +++ |
牛Cow | IgG | + | +++ |
IgG1 | + | +++ | |
IgG2 | +++ | +++ | |
猫Cat | IgG | +++ | + |
马Horse | IgG | ++ | ++++ |
山羊Goat | IgG | + | ++ |
IgG1 | + | +++ | |
IgG2 | +++ | +++ | |
豚鼠Guinea pig | IgG1 | ++ | + |
IgG2 | ++ | + | |
绵羊Sheep | IgG | + | ++ |
IgG1 | + | ++ | |
IgG2 | +++ | +++ | |
狗Dog | ++ | + | |
猪Pig | +++ | ++ | |
大鼠Rat | IgG | + | ++ |
IgG1 | - | + | |
IgG2a | - | ++++ | |
IgG2b | - | ++ | |
IgG2c | ++ | ++ | |
IgG3 | + | ++ | |
小鼠Mouse | IgG | ++ | ++ |
IgG1 | + | ++++ | |
IgG2a | ++++ | ++++ | |
IgG2b | +++ | +++ | |
IgG3 | ++ | +++ | |
IgM | - | - | |
鸡Chicken | IgY | - | - |
恒河猴Monkey rhesus | IgG | ++++ | ++++ |
仓鼠Hamster | + | ++ | |
考拉Koala | - | + | |
美洲驼Llama | - | + |
HB190819