VacciniaCappingEnzyme牛痘病毒加帽酶
时间：2017-07-04 阅读：535
Vaccinia Capping Enzyme牛痘病毒加帽酶
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格（元） |
Vaccinia Capping Enzyme牛痘病毒加帽酶 | 10615ES76 | 500 U | -20℃ | 1256.00 |
Vaccinia Capping Enzyme牛痘病毒加帽酶 | 10615ES84 | 2000 U | -20℃ | 3856.00 |
10615ES92 | 10000 U | -20℃ | 14856.00 |
产品描述
真核生物中mRNA经转录后修饰在5端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5末端（m7Gppp5N）。牛痘病毒加帽酶，在合适浓度的加帽缓冲液（Capping buffer），鸟苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在条件下，能够在一个小时之内对RNA进行加帽，效率可达到100%，并且保证正确的方向。
本品以无菌液体形式提供，可应用于体内/体外翻译前mRNA的加帽反应或mRNA的5末端标记反应。
产品性质
来源（Source） | 携带牛痘病毒加帽酶基因的E. coli |
zui适温度（Optimum Temperature） | 37℃ |
储存缓冲液（Storage Buffer） | 20 mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1% Triton X-100，50%甘油 |
活性单位定义（Unit Definition） | 37℃条件下，1小时内将10 pmol GTP（α- 32 P）掺入到一条含80个核苷酸（80 nt）转录产物上所需要的酶量。 |
运输和保存方法
冰袋运输，-20℃保存，有效期1年。
注意事项
1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
2）所提取的RNA需经过纯化并使用无核酸酶的水重悬；
3）在加入酶之前需要对RNA溶液进行加热以去除5末端的二级结构；
4）对于已知5末端结构的RNA，可以延长反应时间至60分钟，提高加帽效率；
5）5末端标记反应体系中，GTP储液应稀释为反应体系中mRNA摩尔浓度的1-3倍。
使用方法
1. 加帽反应
本步骤适用于10 μg RNA（≥ 100 nt）的加帽反应，且可根据实验需要放大。
1）取10 μg RNA至1.5 mL离心管，使用无核酸酶的水稀释至15 μL；
2）65℃加热5分钟；
3）取出离心管置于冰上5分钟；
4）依次加入以下组分：
组分 | 体积 |
上述变性的RNA | 15 μL |
10×Capping Buffer | 2.0 μL |
GTP（10 mM） | 1.0 μL |
SAM（2 mM） | 1.0 μL |
Vaccinia Capping Enzyme（10 U/μL） | 1.0 μL |
【注】：10×Capping Buffer配方为：0.5 M Tris-HCl，pH 8.0；50 mM KCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT。
5）37°C孵育30分钟；
6）RNA加帽完成，可进行后续实验。
2. 5末端标记反应
本步骤适用于5末端带有三磷酸的RNA标记，且可根据实验需要放大，其标记效率受反应体系中RNA与GTP摩尔浓度比以及RNA样本中GTP含量影响。
1）取适量RNA到1.5 mL离心管，使用无核酸酶的水稀释至14 μL；
2）65℃加热5分钟；
3）取出离心管置于冰上5分钟；
4）依次加入以下组分：
组分 | 体积 |
上述变性的RNA | 14 μL |
10×Capping Buffer | 2.0 μL |
GTP mix | 2.0 μL |
SAM（2 mM） | 1.0 μL |
Vaccinia Capping Enzyme（10 U/μL） | 1.0 μL |
【注】：GTP mix为GTP和少量标记物，其中GTP使用浓度参照注意事项5）。
5）37°C孵育30分钟；
6）RNA 5末端标记完成，可进行后续实验。
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