质粒测序发现基因出现突变，对后续基因表达有影响吗？

意料之外的同义突变，虽不改变蛋白质氨基酸的序列，但可能出乎意料的赋予蛋白质别样的“人生”。

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基因的同义突变

由于密码子的简并性，基因的同义突变不改变原有密码子所编码的氨基酸，因此，蛋白质的氨基酸序列保持不变。

好像我们一直以来，都去了解蛋白的氨基酸的序列是否改变，却没有想过：同义突变后的蛋白，虽然氨基酸序列未发生改变，但其表达水平是真的没有变化吗？

于是我们准备了这篇文章，希望能让大家更好地了解这一现象。

同义突变带来的蛋白表达变化

先看一个同义突变后的小鼠c-Fos蛋白外源性表达的情况。大致是这样子的：c-Fos蛋白在大肠杆菌中外源性不表达。因此，构建两个同义突变的c-Fos基因M1和M2的表达载体，转化大肠杆菌，诱导表达后，分别检测表达量变化。

图1【1】A. 同义密码子改造。M1:140位氨基酸至146位氨基酸中的精氨酸使用*化的密码子的c-Fos蛋白。M2：119位氨基酸至159位氨基酸中的精氨酸使用*化的密码子的c-Fos蛋白。B.IPTG诱导重组质粒的表达，3h后Western Blot测定表达量。1：未经突变的c-Fos蛋白；2：M1；3：M2；4：c-Fos纯化蛋白。

聪明的你，一定会发现：相较于未发生突变的c-Fos蛋白，同义突变后的M1蛋白表达量无变化，M2蛋白表达量增加。因此，同义突变对于蛋白而言，除了氨基酸序列不变外，正如你我明日的生活，前路漫漫，不可预测，惊喜连连。

同义突变影响蛋白表达的原因

与你一样，我也对什么样的同义突变会引起蛋白表达量变化产生了疑问？

简并性的密码子也被称为同义密码子。在基因组中，同义密码子的使用频率存在差异，这种现象被称为密码子使用偏好性。那些使用频率高的密码子，我们叫做偏爱密码子；剩余的则为稀有密码子。那么，那些被偏爱的密码子是否有恃无恐地协助蛋白表达呢，下面列举几种同义密码子影响蛋白表达水平的机制。

一、翻译选择机制

认为翻译速率和翻译准确性的自然选择导致优先选择偏爱密码子。

1.偏爱密码子具有更高的翻译延伸速度，可节约蛋白的翻译时间，同时节省细胞内有限的核糖体资源。此外，较高的延伸速度可提升细胞翻译起始过程的进行，有利于细胞所有基因的表达。

2.对那些偏爱密码子，正确的氨基酸会很快被连接上；但对稀有密码子，要经过多次相互辨认才能找到正确的氨基酸，这样蛋白合成受阻。当稀有密码子较多时，会发生明显停顿，抑制蛋白合成。同时，非对应氨基酸错误掺入率增加，蛋白翻译出错率增高，合成的蛋白对于细胞而言，是浪费甚至是有毒性的。

图2 Degenerate codons do not necessarily lead to equally efficient expression of an amino acid.

二、同义突变也会影响mRNA水平

除了翻译过程中，对于密码子偏好性的选择外，密码子使用偏好对mRNA水平的调控作用也是影响蛋白表达水平的因素。

中国科学院遗传与发育生物学研究所钱文峰研究组揭示同义密码子对于mRNA水平的调控于今年8月底发表于Molecular Biology and Evolution。课题组在酵母中合成了GFP的同义密码子突变体，发现同义密码子的使用可以调控mRNA水平，同义突变后，偏爱密码子使用率高的同义突变体，其mRNA的水平高。

图3 同义密码子调控mRNA水平，并且该调控可能通过影响mRNA降解速率而实现。CAI：密码子适应指数。同义突变中，偏爱密码子越多，CAI值越大。Log₂(mRNA)：mRNA的丰度。

mRNA的表达水平是由其产生和降解的平衡所决定的，为了证明调控可能是通过影响mRNA的稳定性（即影响降解过程）实现的，在使用转录抑制剂硫藤黄素thiolutin后，检测不同时间点的同义突变体的mRNA水平。发现偏爱密码子的同义突变体的mRNA更稳定。文章进一步解释了密码子使用偏好与邻近序列也有关系。

如何优化或避免同义突变？

由实验需求的不同，可能需要出现同义突变或避免出现同义突变。对于需要通过密码子优化改变蛋白表达量的实验（如蛋白纯化等），提供一篇关于密码子优化的参考文章：Codon bias and heterologous protein expression（Trends in Biotechnology）。

而对于担心同义突变造成蛋白表达变化的实验，构建载体时，克隆基因使用高保真度、突变率低的DNA聚合酶至关重要！

参考文献

1. Deng T. Bacterial expression and purification of biologically active mouse c-Fos proteins by selective codon optimization. FEBS Lett. 1997 Jun 9;409(2):269-72.

2. Zhou T, Weems M, Wilke CO. Translationally optimal codons associate with structurally sensitive sites in proteins. Mol Biol Evol. 2009 Jul;26(7):1571-80.

3. Yu CH, Dang Y, Zhou Z. Codon Usage Influences the Local Rate of Translation Elongation to Regulate Co-translational Protein Folding. Mol Cell. 2015 Sep 3;59(5):744-54.

4. Zhou Z, Dang Y. Codon usage is an important determinant of gene expression levels largely through its effects on transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Oct 11;113(41):E6117-E6125.

5. Chen S1, Li K, Cao W. Codon-Resolution Analysis Reveals a Direct and Context-Dependent Impact of Individual Synonymous Mutations on mRNA Level. Mol Biol Evol. 2017 Nov 1;34(11):2944-2958.

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