Anika Manzke是病毒清除产品经理，Birte Kleindienst是病毒清除产品初级经理，二人均供职于Sartorius Stedim Biotech

细菌、支原体和病毒等各种感染因子对生物反应器的污染会对患者安全构成潜在的威胁。近年来，病毒一直是导致多种生物反应器污染的原因（1）。许多生物制药公司已经报告过鼠细小病毒（MVM）或疱疹病毒属（2）等无包膜细小病毒对生产级生物反应器造成的污染。制药行业中的许多重量级公司都加入了CAACB来共同解决这一问题。

制造商可以采取多种方法降低细菌或支原体引起的细胞培养污染风险。但是，病毒（特别是无包膜细小病毒）引起的污染风险，即使是在使用化学限定培养基（1）的情况下，对生物制药行业而言仍然是一个巨大的挑战。

传统的除菌级过滤器,即使是0.1微米的过滤膜都不能防止无包膜微小病毒造成的污染。

病毒污染比细菌污染（3）更难以检测。未能检测到的病毒可能会污染整个下游过程，甚至是终药品。许多公司因鼠细小病毒或疱疹病毒属（2）污染而遭受了生产损失。针对所有上述情况，根源分析显示，可能的源头是在供应链（4-6）早期储存过程中的培养基组分（如盐）污染。

图1：病毒污染事件的逐渐升级关联效应

防止老鼠进入这些仓库的措施不够充分。

这些污染事件可能对患者造成致命的后果。 

这些无包膜病毒的稳定性高，因此它们可以长期存活。即使是一个感染性颗粒也会污染整个生物反应器。这一个颗粒会在生物反应器中迅速复制。在它进入生物反应器之前，要在1000 L的培养基中找出这一个颗粒无异于大海捞针。

 污染影响

这种污染事件可能对患者造成致命的后果（参见图1）。如果公司发现存在污染，不仅需要关闭工厂，还需要进行大量的清洁工作。由此便可能导致药物短缺，患者不能获得救生药物（7）。

上游病毒清除解决方案

上游工艺中需要有新的病毒清除理念。

过去，研究人员已经研究了伽马辐射、UV-C照射或高温短时处理（HTST）等技术去除细胞培养基病毒的能力。如牛血清在伽马照射下能清除大部分的病毒（8）。高温短时处理需要大量投资，因此它仅在高流速下处理大量培养基时才是经济可行的（9）。然而，并非所有培养基组分都是热稳定的，而高温短时处理系统线性放大也并非易事。UV-C受限于可应用的流速，因此在制备大体积的培养基时应用有限。此外，从这些公开发布的方法数据来看，这些技术在灭活无包膜细小病毒方面的效果也良莠不齐。迄今为止，过滤这项有效的技术（对无包膜病毒特别有效）尚未被广泛应用于培养基过滤（10）。

下游病毒过滤器的瓶颈

为达到理想的病毒清除效果，一些公司已经采用下游工艺中的除病毒过滤器来进行培养基的过滤制备，以此尽量减少病毒污染的风险。因为生产时间长，流速低，所以公司可有效地将这些过滤器用于过滤灌注生物反应器的培养基中的潜在病毒。采用传统的下游工艺（DSP）过滤器过滤化学限定培养基时，培养基的过滤载量相当高，能高达10.000 L/m²（11）。

如果可以在几天内而非数小时内过滤这些培养基，传统的DSP过滤器则是的解决方案，而且经济上可行，因为小过滤面积已经足以满足需求。然而，在传统的批量过滤中，情况并非如此。由于细菌污染的风险，培养基必须在至少24小时内过滤，且理想情况下是在一个班次内。为了提高过滤的整体速度，则需要更大的过滤面积，但这种方法成本昂贵，在经济上不可行。

经济上的可行方案

生物制药行业需要解决将下游工艺除病毒过滤器用于上游培养基除病毒过滤的低流速和高成本问题，使其在经济上可行。这是开发专门用于培养基过滤（10）的代病毒截留过滤膜的背景。

方法

截留性能

每个5.0cm²的实验室用除病毒滤器都经过了病毒挑战实验. 实验采用了作为“差条件”下的非脂包膜指示病毒-MVM 。它是细小病毒家族的12-26纳米单链无包膜ssDNA病毒。实验使用5.0cm²的除病毒滤器，在2.0bar的恒定压力下过滤3种不同的培养基，并进行二次重复实验。在1%的病毒加入量下，过滤了400 L/m²。

膜载量测试

膜过滤载量采用了三个不同供应商的15种不同培养基来测定。所有测试均在2.0bar的恒压下进行。

表1：新型除病毒培养基滤器的截留能力，实验室用滤器（5 cm²）。

图2：在4小时的过滤时间内，15种细胞培养基（CCM）在恒压2.0bar下的通过量一览；培养基除病毒过滤器，实验室用。

4小时过滤后对总过滤量进行了测量。

结果

截留性能

表1总结了使用新型膜进行测试的截留数据。膜的病毒截留性能同下游工艺应用中使用的过滤器相当。无包膜细小病毒MVM的截留量超过4个对数值。分析方法检测不到滤液中的MVM。可合理预期该膜会截留比细小病毒更大的潜在污染因子。

不同化学限定成分细胞培养基的膜通过量

膜的通过量采用了三个不同供应商的15种培养基来测定。图2表明了在2bar压力下，4小时的培养基处理载量因培养基组分不同而差别很大。例如，Lonza Power CHO2相对较快地造成了膜堵塞，而Lonza ProPER1培养基似乎*不堵膜。

对于一些商业化细胞培养基，使用串联0.1微米过滤器显著提高了除病毒过滤膜载量（7）。但仅部分培养基可行，有些则没起作用。诸如泊洛沙姆等保护剂大幅降低了过滤流速（10）。

对于一些商业化细胞培养基，使用串联0.1微米过滤器显著提高了膜通过量。

降低泊洛沙姆浓度或在添加至培养基以前过滤能大幅提高过滤器的过滤量。业界应该展开更多研究，从而充分了解不同培养基组分对培养基过滤器过滤性能的影响。根据本研究，可设计出一种既能改善过滤性能又不影响后续细胞培养工艺的培养基。不过，研究表明，在细胞培养基通常的4小时过滤中，开发的新膜通常过滤载量约1000 L/m²。因此，对于批量制备培养基，这种新膜是经济上可行的办法，同时也降低了细胞培养基的病毒污染风险。

结论

在本文中，作者介绍了一种新的病毒截留膜，上游工艺工程师可使用它来过滤化学限定培养基，从而降低风险。此外，作者已经证明该方法可截留4个Log以上的非包膜细小病毒。当过滤一系列不同型号的化学限定培养基时，该膜的通量较高，生物制药公司能够在上游工艺中使用这种膜，而且不会对工艺成本造成不利的影响。该膜有可能成为基于风险控制来zui大程度地降低病毒污染事件的重要环节，同时提高生物制药公司的生产能力。

REFERENCES

1.P. W. Barone, PhD, “Lessons Learned from the Consortium on Adventitious Agent Contamination in Bio Manufacturing,” Viral Safety for Biologics, Cologne, June 21, 2016.

2. Bethencourt, Nature Biotechnology 27, 681 (2009), www.nature。。ｃｏｍ/nbt/journal/v27/n8/full/nbt0809-681a

3.O.-W. Merten, Cytotechnology 39, 91–116 (January 9, 2003).

4.M. Moody, PhD, “MMV Contamination–A Case Study: Detection, Root Cause Determination, and Corrective Actions,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

5.Jim Skrine, “A Biotech Production Facility Contamination Case Study–Minute Mouse Virus,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

6.Linda Hendricks, “Case Study of Apparent Virus Contamination in Biopharmaceutical Product at Janssen,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

7.B. Kleindienst, “Proof of Concept–The first virus retentive membrane for risk mitigation in upstream,” Viral Safety & Raw Materials for Biologics, Cologne, June 22nd, 2016.

8.G. Gauvin and R. Nims, PDA Journal, Vol. 64, No 5, 432-435, 2010.

9.B. Hansmann, V. Thom, A. Manzke, “Contamination Risk Mitigation in Cell Culture Media Preparation,” Virus & TSE Safety Forum, Lisabon, June 9-11, 2015.

10.A. Meyer, “Risk Mitigation in Media Preparation—Current Possibilities and Future Trends,” PDA Virus & TSE Safety Forum, Berlin, June 5, 2013.

Thomas R. Kreil, “Virus Safety—A Look into the Entire Process Raw Materials, Upstream, Downstream,” European Upstream and Downstream Technology Forum Goettingen, September 8-10, 2014. ◆

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