前言

陈老师最近不再只热衷研究分子互作了。体外分子水平的研究要结合细胞学的体内研究，才能得到更全面更真实的认识。尤其是免疫学研究中的细胞学实验，包括细胞形态，细胞功能，细胞间的相互作用等，更是被越发看重。传统的方法，比如某个时间点对细胞固定染色通过显微镜拍照的方式观察细胞的变化情况，或是用流式、ELISA、PCR等终点法实验对细胞的免疫反应进行检测，而且这还不是活细胞状态。

如果能够通过实时动力学反映出活细胞的状态随时间的变化，岂不是更好？

 

这不，陈老师最近好好地研究了一番赛多利斯生物分析的三剑客之一——Incucyte®实时活细胞分析系统，直接把设备置于细胞培养箱内，不需要拿出培养箱观察，即可对活细胞的行为进行实时、动态、连续地监测，可长达数周，即可得到生长曲线/IC50/EC50，又可生成图片及视频。这可太适合免疫学相关的细胞学实验了。

 

免疫学研究中常见的细胞实验：

• 基础研究：细胞增殖、免疫分型、免疫细胞激活与分化、细胞健康与凋亡等

• 细胞功能：免疫细胞杀伤、吞噬与清除作用、NETosis等

• 药效评价：趋化/迁移、抗体内化、病毒感染等

有了Incucyte®实时活细胞分析系统，以上这些应用与分析都信手拈来。

 

今天陈老师就先给大家介绍其中的五个应用：

1. 细胞增殖及计数

2. 细胞鉴定和免疫分型

3. 细胞激活和分化

4. 细胞健康和凋亡

5. 免疫细胞杀伤（细胞溶解）

01

细胞增殖及计数

相比传统“终点法“，Incucyte®利用实时活细胞分析更高效地得到细胞增殖及计数结果（表1），并提供灵活、便捷的实验方案（图1）。既可以直接进行无标记的细胞汇合度分析，又可通过专业的Incucyte® Cell-by-Cell Analysis软件进行无标记的细胞计数。通过面积尺寸、形状及荧光强度等指标在单个细胞水平上对视野中的所有细胞进行自动分析和计算，得到生长曲线等数据结果。

表1. 终点法细胞增殖测定 vs 实时活细胞技术细胞增殖测定

图1. Incucyte®细胞增殖及计数分析
 

02

细胞鉴定和免疫分型

荧光标记的CD抗体（Abs）被广泛用于流式细胞术进行细胞识别和免疫分型，至少有15种人类T细胞亚型被描述出来（例如，CD4+，CD8+等）。Incucyte®利用相同的原理，对标记方法进行改进：

将抗CD抗体结合到同型匹配的带有荧光标签的Fc区域靶向Fab片段，便可通过简单的一步混合来完成标记。在检测中使用一种非干扰性的背景荧光抑制染料，以改善488 nm的荧光信号，保护细胞的同时提供更灵活的分析方案。
 

03

细胞激活和分化

免疫细胞的分化和激活是免疫力和免疫应答的关键步骤。细胞通过受体信号传导进行扩增并产生功能效应，最终导致基因表达、分化和表型变化。Incucyte®能够更清晰、更深入地研究这个过程的复杂性和动态性：

a. 通过无标记或荧光标记，对免疫细胞活化的形态变化进行实时监测；

b. 使用cell-by-cell软件模块对细胞的图像分割，进行细胞分类；
c. 使用Cytolight Rapid试剂监测活化T细胞聚团
 

04

细胞健康和凋亡

细胞健康和细胞凋亡的测量对于研究药物、培养条件或基因改造对细胞生长或活力的影响至关重要。 Incucyte®通过使用专为活细胞分析而优化的荧光染料，提供了一种非干扰的、“即混即读”分析方式对细胞凋亡、细胞死亡的时间过程以及它们与细胞增殖的关系的洞察。

Caspase 3/7染料在存在活性caspase的作用下发出荧光，可检测长期和短期效应；Annexin V染料与细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸结合检测早期凋亡，细胞非通透性的DNA结合荧光探针则可用于检测细胞膜的完整性。该方法适用于贴壁细胞及非贴壁细胞，并且，无需将细胞从培养箱中取出即可分析细胞健康和活力，保护细胞、节约时间、提高质量。
 

05

免疫细胞杀伤（细胞溶解）

细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）、自然杀伤细胞（NK）和某些中性粒细胞能够杀死被感染的或恶性细胞。对于细胞杀伤的检测，可通过检测垂死的目标细胞中的释放的Cr-51和细胞酶（如LDH）等来实现。但这些传统方法存在诸多弊端，例如放射性。而检测技术的关键挑战在于：

(1) 高背景信号；
(2) 难以辨别可能来自效应（杀伤）细胞的污染信号；
(3) 如何判定并测量杀伤终点。

Incucyte®巧妙解决了以上难题。无需取出细胞、无需同位素或抗体标记，免清洗。利用实时、连续的成像方式捕捉细胞随时间的变化信息。其中可以用荧光蛋白（如RFP）标记目标细胞，当它们被裂解时，监测荧光的损失。另外也可直接采用annexin V或caspase 3/7测量目标细胞的凋亡。这些方法对于表征检查点抑制剂、CAR-T细胞、双特异性抗体和其他基于免疫的疗法的表型效应非常有用。

 

既能不受培养环境限制进行活细胞观察，又能实时分析得到动力学变化过程，就这么简单～陈老师今天先介绍到这里，还有5个应用，请看下回分解～