近年来，全球生物医药产业发展正处于快速上升期，医药健康行业也将迎来新一轮的变革与机遇。其中，细胞与基因治疗药物、抗体药物书写创新生物药新篇章，被认为是未来医药领域发展的主力军。但无论是抗体药物的生产还是基于病毒载体的基因治疗药物的制备，都离不开稳定高效的细胞株开发。

据Global Market Insights数据预测，CLD市场规模在2021年约为58亿美元，预计从2022年到2028年将以每年约10.1%的复合年增长率增长，到2028年将达到约117亿美元。

CLD作为生物药CMC的起点和基础，构建一个适合于生产的高表达稳定细胞株至关重要，因为其在很大程度上决定了药物开发的效率和成本。

CLD与古法造纸过程类似，成本昂贵、耗时长，开发流程如同雕版印刷中的勾刻印绘裱，每个步骤都涉及复杂而精细的生物分析和质量研究工作，并且需要优化的细胞培养工艺，以确保能够成功进行商业生产。

在CLD早期工艺开发阶段增强对未来潜在挑战的认识有助于降低失败风险，减少重复工艺相关费用，并确保最终的生物药满足监管要求。目前，CLD面临着一些技术上的关键挑战，例如大批量克隆筛选、早期表征分析和优化以及可扩展性、细胞株稳定性等。

面对不同的生物药开发，如何实现高效、高质量的CLD？在工艺上又可以通过哪些手段或方案来满足预期的商业化需求？下面就让小编给大家细细道来。

目前CLD的标准流程步骤包括：基因克隆和初始克隆筛选、克隆筛选和验证分析、细胞培养及培养基优化、评估和表征分析以及最后的细胞库建立。整个开发周期一般需要12-18个月，对标准化流程中的每一步工艺改进都将影响CLD整体进程。

▲ 高效细胞株开发工艺流程

宿主细胞系直接影响产品的特定属性，比如糖基化、羧基化、羟基化、酰胺化等；甚至还可能影响半衰期、免疫原性和生物学活性。宿主细胞系应有完整表征以及完整的记录，并不含TSE/BSE等病毒污染因f素。另外，宿主细胞还应适合无血清培养基，或者无动物来源成分的培养基中悬浮生长。

近年来，随着技术的发展以及研究的深入，有超过75.6%的生物药采用哺乳动物细胞表达体系，其包括人源细胞和非人源细胞，其中在这部分里有超过83%的生物药采用了非人源细胞系的CHO(Chinese hamster ovary)细胞进行CLD。

▲ 2014-2020年获批的生物制剂应用的细胞表达体系比例

Octet®分子互作分析系统采用生物层干涉（BLI）技术，是一种无标记的、实时监测的技术，主要用于生物分子间相互作用动力学参数及蛋白浓度测定。使用Octet®，能够对纯化的样品和异质的粗样品裂解液中的IgG 浓度进行量化，最多可选96通道，10分钟内检测一块384孔板。

▲ 生物分子的表达载体和转染流程（图片来源：参考资料3）

这里，应该注意的是，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，在选择转染方法时，需要考虑细胞类型、产品表达量需求、安全性、经济性、工艺放大、周转时间和法规要求等多方面因素。理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和具有可重复性等特点。目前常用于哺乳动物细胞转染的方法有磷酸钙法、阳离子脂质体法、病毒转染法和电穿孔法。

另外，在转染过程中，化学限定的细胞培养基已经成为当下CHO细胞生产工艺的金标准。

在有关CHO培养基和克隆筛选方法的对比分析的研究中，研究人员运用培养基基准测试并充分利用Ambr® 15微型生物反应器平台进行克隆/培养基各种组合的培养基筛选，在相同大小、多并行的生物反应器中比较培养物，建立多个实验以评价不同的细胞系或克隆，并研究工艺参数的影响，例如温度、补料、培养基成分、通气量和接种密度。

并使用Octet®非标记分子互作分析系统对其进行滴度、结合活性以及糖基化分析等一系列检测。

结果显示结果显示，4Cell® XtraCHO培养基，在细胞生长、存活率、产量、糖基化分析方面，性能优于对照组培养基（详见文章：高效细胞株开发：高通量细胞培养及滴度测定）。

iQue®高通量流式细胞仪能够快速监测细胞健康和活力，使用人IgG滴度和活力分析试剂盒可以很好地评估悬浮CHO细胞，同时定量测定其分泌蛋白，以快速识别先导克隆，在短时间内增加克隆评估数量，5分钟内完成一块96孔板检测。

ForeCyt®软件上的Panorama功能具有动态多板数据分析能力，包括可以用户自定义标准的图谱，用于检测和识别包含所需IgG同种型抗体浓度和细胞健康的样品，这在多板筛选分析时非常重要。小鼠IgG亚型和产量检测能够简化和加速抗体发现的工作流程，这意味着更短的时间获得更多的分析结果。具体而言，将稳定的Minipool与采用荧光标记的亲和分子或特异性抗IgG抗体一起孵育，以表征细胞表面上分泌的重组蛋白量，从而能够识别和富集高产Minipool。

单克隆性不足可能引发一些问题，例如：生长速率、代谢特征、重组蛋白Qp稳定性、产品质量等方面的差异。若Minipool由生长速率（μ）和Qp有微小差异的细胞组成，则μ高的低产Minipool将逐渐在数量上超过μ低的高产细胞群。据报道，这种情况下仅9%的生长优势便足以使细胞在25代内出现过度增殖，这意味着工业生产必需采用基因和表型方面高度均一化的单克隆。

因此，需要采用先进的技术手段以该类Minipool的单个细胞为起点进行克隆，以确保生产用的所有细胞均来自单个细胞。对选定的Minipool进行克隆、培养和评估，在多次迭代选择之后，最终的细胞库由具有相同遗传学特征的细胞（克隆群体）组成。目前，常用的细胞单克隆方法包括但不限于以下四种：传统的有限稀释法（LDC）、基于荧光激活细胞分选技术（FACS）、高通量自动化显微技术、自动化克隆系统等。

作为LDC或FACS单细胞分选技术的主要替代方法，CellCelector平台可实现高精度、高通量的单细胞及克隆筛选。通过结合高精度的机械臂技术及优化的采集模块，能够自动进行排序及筛选，实现基于图像的单克隆性证明和克隆活力评估，同时准确分离出完整的高活率单细胞、贴壁克隆等，提高CLD效率。

此外，因为涉及产品的安全性，细胞的单克隆源性验证在确保生物制药产品的纯度和均一性上至关重要，因此FDA的政策和法规都强制要求生物制药企业提供清晰图片证据，用以证明单克隆生物药研发过程中的单克隆源性。

▲ 克隆筛选（图片来源：参考资料5）

另外，早期克隆筛选的通量很高，因此必须有一个运行非常平稳和高效的优化过程，包括细胞计数和滴度测定的适当方法，而这些方法都需与高通量兼容。这意味着必须确保筛选了足够数量的克隆，才能得到真正想要的类型。

Octet®分子互作分析系统不仅能够快速定量粗提物中的蛋白，而且拥有针对检测ProteinA、HCP残留、唾液酸含量以及甘露糖含量的商业试剂盒，用户可以在早期CLD阶段快速筛选出高质量细胞株，也可以在Octet®系统上轻松开发项目所需的高灵敏度定量分析方法。

接下来，完成克隆筛选后，需要进一步验证生物药产品的生物活性、功效及关键质量属性（CQA），这些关键信息将为下一步实验开展及工艺开发提供重要指导。Octet®分子互作分析系统可以进一步对生物药产品的关键质量属性（CQA）进行评价，得到优单克隆细胞株。

传统的摇瓶培养筛选方法，因为无法提供一个良好稳定的培养环境，导致工艺放大性差，频繁出现错筛和漏筛的情况，最终产生大量无效重复的工作，在一定程度上延长了CLD周期，Ambr®15高通量微型生物反应器系统，采用与玻璃罐反应器相似的物理设计以及配套的数据处理系统，可以高效准确获取克隆的真实性能。

Octet®BLI系统作为高通量非标记分子互作平台，不仅可以进行滴度检测，还可以对抗体进行一系列的表征分析，提供详细的表征分析说明书，加快药物申报上市的速度。

除此之外，还需对所选细胞进行严格细致的测试，以保证其遗传稳定性，并确保其不含任何病原体及其它未知因子。  

Summary

从雕版到活字，印刷术的发展为CLD流程开发提供了直接的经验性启示。未来仍需要在发展的过程中不断优化CLD的流程。除了采取不同的优化策略，稳定高效的CLD还需要开发更加先进设备。不久前，赛多利斯发布了有关CLD的白皮书，其概述了CLD工艺流程以及生物制药公司在建立CLD流程时面临的关键挑战和优化策略，以帮助有CLD需求的生物制药公司了解更多工艺细节。