BLI变身PLI? Octet又又又解锁新应用！
时间：2024-04-16 阅读：268
利用噬菌体病毒选择性感染和杀死致病菌，称为噬菌体疗法。目前，噬菌体筛选的主要手段包括基于光学的测定，不能在复杂的介质中进行，如有色溶液、不均匀混合物或高粘度样品。
为应对这些挑战，研究人员采用基于生物层干涉技术（Biolayer interferometry，BLI）的Octet®非标记分子互作分析系统，建立了噬菌体层干涉术（Phage-layer interferometry，PLI）作为噬菌体伴随诊断方法[1]。
PLI不仅为一种定量的噬菌体筛选方法，同时可以作为细菌检测平台。PLI易于自动化，还可以在复杂、不透明的介质中发挥作用，如婴儿配方奶粉。PLI方法的建立，将对预防食源性疾病及对抗AMR（抗生素耐药性）产生直接而广泛的影响。那么，PLI技术又是如何诞生的呢？接下来让我们一睹为快！
图1. PLI实时监测细菌结合和裂解：
第1步，baseline,缓冲液平衡；
第2步，噬菌体固化在Octet®传感器上；
第3步，细菌结合；
第4步，缓冲液中解离
PLI方法开发
鉴于噬菌体T7展现出极高的治疗潜力，研究者因此选择其来合成噬菌体功能化的BLI传感器，用作PLI噬菌体生物传感器的原型。首先，将纯化的T7进行生物素化，并通过透析法去除多余生物素，然后T7-bio就可以固化在SA传感器上。
上图：噬菌体生物素化示意图；左图：T7噬菌体固化的信号较高，说明其可以成功固化在SA传感器上
图2. T7噬菌体生物素化和传感器固化示意图
研究人员通过扫描电子显微镜（SEM）进一步确认了传感器表面的T7的功能化不受影响。固化后的噬菌体平均长度和直径分别为85±15nm和66±11nm，与之前研究报道的3D 冷冻电子断层扫描衍生模型计算出的尺寸非常吻合。由于Octet®传感器是由玻璃光纤制成，可以在SEM下直接观察。
图3. 固定化T7颗粒的代表性SEM图像与冷冻电子断层扫描3D模型的比较
PLI方法评估
噬菌体宿主范围筛选：将T7传感器浸没在细菌肉汤培养物中并通过PLI信号随时间的变化来研究噬菌体-宿主动力学。通过BW25113（敏感菌株）和BW25113 ΔwaaCΔtrxA（耐药菌株）进行测试，发现BW25113与T7传感器的结合信号更强，并进行重复试验确认了PLI良好的重复性。这一发现证明PLI在研究噬菌体宿主范围时可通过比较噬菌体结合能力参数进行筛选。
图4.细菌结合的PLI信号：BW25113（敏感菌株）PLI信号比BW25113 ΔwaaCΔtrxA（耐药菌株）高
量化噬菌体感染参数（如宿主结合和潜伏期）：细菌结合后将传感器洗涤并在LB中孵育测量裂解动力学。由于细菌解离，BW25113和BW25113ΔwaaCΔtrxA前期检测信号略有下降。120分钟后，BW25113信号急剧增加后迅速降低，表明噬菌体感染引起细菌肿胀后裂解（划重点！在解离观察到信号起伏就说明细菌被噬菌体裂解了！）。而BW25113ΔwaaCΔtrxA没有产生“裂解”信号。考虑到PLI是实时的检测，所以在PLI中可观察到单个感染周期，因此可以推断噬菌体潜伏期，T7在室温下的潜伏时间为193 ± 26分钟。通过PLI测定潜伏期与传统方法相比操作更为简单。
图5.在解离步骤中，PLI发现BW25113细菌裂解
研究人员还通过SEM确认了传感器的细菌裂解碎片上覆盖着T7（白色颗粒），从而证实噬菌体传感器诱导的细菌裂解。
图6. 传感器表面上细菌裂解和裂解产物的代表性图像：C图为菌体开始裂解，但是菌体相对完整；D，E图为裂解后的细菌，并附着噬菌体
PLI实战1—能被噬菌体裂解的细菌筛选
研究人员使用ECOR集合（该集合包括来自世界各地的大肠杆菌菌株）中的30种细菌筛选T7宿主范围，并与传统的噬菌体筛选方法DLA(双琼脂覆盖试验)进行对比。结果显示PLI比传统方法具有更高灵敏度，如ECOR-16在DLA测定中未被确定为敏感，但在PLI检测中观察到裂解信号后，重新分析DLA培养皿，可在最浓缩的稀释度下显示出小斑块。可见，PLI测量噬菌体宿主范围的能力更强，并易于比较噬菌体感染参数如宿主结合动力学和潜伏期，从而实现更标准化的噬菌体候选物筛选过程。
图7. PLI检测ECOR集合中 30 种菌株的结合和裂解
PLI实战2—奶粉中诊断细菌
由于噬菌体通过结合细菌来诊断细菌的存在，而Octet®具有在复杂样品中检测的能力，因此研究人员将PLI用于检测婴儿配方奶粉的细菌污染。婴儿配方奶粉是不透明的，很难通过传统的光谱方法进行分析。将T7生物传感器浸入婴儿配方奶粉中检测，与未污染的奶粉相比受污染的奶粉的结合信号更高。在LB培养基中解离，观察到受污染的奶粉检测信号存在裂解特征，未污染的奶粉仅显示非特异性结合分子从传感器表面的解离信号。
图8. PLI检测污染的婴儿配方奶粉：左图，在奶粉中，噬菌体结合细菌PLI信号；右图，在LB培养基中解离，发现细菌的裂解信号
Octet®还提供其他配套的传感器固化病毒，比如本文还用AR2G（氨基偶联）传感器结合带正电荷的聚乙烯亚胺（PEI）聚合物，再捕获与噬菌体结合的细菌，并进行检测，其结果与生物素化后固化在SA传感器结果类似。
以上就是BLI变身PLI的全过程，PLI之所以适合于复杂样本检测以及长时间（400-500mins）细菌裂解动力学监测，主要得益于Octet®技术特点，浸入即读的模式可以使检测样本不受限制，无流路的限制可以在长时间检测时节省大量样本!
除了以上优势Octet® BLI还具备以下特点：
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非标记Direct Binding是趋势，不需要标记和信号放大，可以更好的保持反应物的活性
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快速测定亲和力，提供结合速率常数和解离速率常数更加定量化地表征分子互作
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无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）
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写入了美国药典，文章多，认可度广
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万金油技术，可以用与检测小分子，蛋白质等各种生物分子，还可以检测细菌，噬菌体等
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操作简便，耗材及维护成本低
-参考文献-
[1] Needham, P., Page, R. C., & Yehl, K. (2024). Phage-layer interferometry: a companion diagnostic for phage therapy and a bacterial testing platform. Scientific reports, 14(1), 6026. https://doi.org/10.1038/s41598-024-55776-1