降本增效｜微生物单细胞测序体系瘦身大法
时间：2024-04-24 阅读：213
2022年，哈佛大学和麻省理工学院团队发表在Science期刊关于微生物群落研究方法学重要突破的研究成果宣告微生物单细胞时代正式开启[1]。
这个在近年国自然基金项目中也被屡屡点名的微生物单细胞基因组学(SCG)提供了获取稀有和暂无法培养微生物基因组的途径微生物基因组学是宏基因组学的补充方法。由于单个微生物细胞中的基因组含量在飞克水平，如需进行全基因组扩增(whole genome amplification, WGA)，则最常见的WGA方法是单个微生物细胞基因组多重置换扩增法(multiple displacement amplification, MDA)，但该方法的成本昂贵，并且其对特定基因组区域的偏向性会降低高通量扩增效率，导致基因组扩增产物覆盖不均匀。因此，获得高质量细分细菌种群，特别是微生物群落中的少数成员的全基因组信息变得异常困难。
图1. 不同的微生物单细胞基因组测序方法比较
1
不同通过减少微生物单细胞测序反应体系总体积的方法比较
过往的研究发现减少WGA反应体系总体积的微缩化方法已被证明可以增加模板的浓度，并减少背景污染被放大的机会，改善微生物基因组DNA扩增产物的基因组覆盖率和序列偏好均匀性的挑战。如今，反应体积微缩化理念的方法已应用于各种不同的单细胞基因测序微流控装置。
图 2. 颜色代码表示不同微流控装置的相对优势，从绿色(优势较强) 到橙色，再到红色(优势较小)。
Volume reduction approach: 反应体系微缩化方法;
Cell throughput: 细胞检测通量;
Scale-up Flexibility: 反应体积放大灵活性;
Average Costs: 平均使用成本 ;
Fabrication complexity:操作复杂度
然而，并不是每一家实验室都能自主研发或者具备一套以上原理的商业化系统，且这些系统擅长的应用场景是真核单细胞测序[2]。为应对这一挑战，在一项富有创意的微生物单细胞基因组测序方法学改良前沿研究中，德国卡尔斯鲁厄理工大学的研究人员知难而上，借助I.DOT MINI非接触式自动化微量分液系统可实现纳升级极限分液体积的性能，提出并证实了一种通过大幅减少基因组测序反应体系的MDA改良方法。结果发现该微缩化方法不但可以显著降低测序成本，同时提高了常规384孔板中微生物基因组DNA扩增产物的基因组覆盖率和序列偏好均匀性。
2
改良的微缩化微生物单细胞基因组测序MDA法流程
滑动查看
A
环境微生物样品应立即进行实验处理或利用冷冻保护剂深度冷冻以保持细胞的完整性
B
细胞通常用非特异性荧光染料染色，如DAPI或SYBR®Green或其他特异性标记如FISH
C
利用平台或单个实验室常见的单细胞分离技术将单个细胞物理分离到多孔板中
D
使用碱性缓冲液和冻融循环的组合将单个细胞裂解释放基因组DNA
E
由于一个典型的原核微生物细胞只含极微量的飞克级基因组DNA，因此需要全基因组扩增(WGA)来产生足够数量的DNA以制备文库
F
一旦DNA文库准备好，可以分别使用短读长和/或长读长基因组测序平台进行测序
G
最后利用生物信息学对序列进行质量评价、装配、分类、ORF调用和注释
在以上微生物单细胞基因组测序MDA改良法步骤中：
-
I.DOT MINI非接触式微量分液系统将微量裂解液分配到含细胞和不含细胞的培养板孔中(阴性对照)。在21℃下孵育10分钟后再加入等体积的中和缓冲液。
-
在WGA测序文库制备体系的步骤中，利用I.DOT MINI将测序反应主混合液(MasterMix)以nL至uL级的梯度分液体积分配到含裂解细胞孔和负对照孔，这样最后的MDA反应总体积呈现为梯度的nL至uL级总体积500nL, 800nL, 1.0uL, 1.25uL, 5uL, 10uL。这些MDA反应体系在PCR仪中进一步孵化即得到扩增后的微生物单细胞基因组DNA模板用于测序文库准备。
3
改良的MDA法单细胞基因组测序结果
图3. 改良MDA微生物单细胞测序结果统计
与WGA-X™等现有的方法相比，改良型MDA的微生物单细胞基因组覆盖率取得了很大改进，以仅仅1.25uL反应体系的reads覆盖了大肠杆菌基因组的85±13%，比其他总反应体积多覆盖19% ~ 40%。在未改进的WGA-X™方法体系下10uL反应体系得到了36±21%的覆盖率，与本改良方法中的10uL反应相比，改良方法比未改进方法的覆盖广度增加了约19%。这些结果表明，在1.25uL反应体积下进行的MDA大大改进了该方法，与标准的、更大的反应体积相比，可以产生更少的基因组偏差、更少的样品污染和更完整的微生物基因组覆盖度。
改良的反应体积微缩化MDA微生物单细胞基因组测序方法使得研究者仅需使用普通384孔板以及实验室常规可用的单细胞分选设备，联合I.DOT MINI非接触式纳升级微量分液系统的极限微量分液能力即可轻松实现。从未改良的标准50uL MDA反应中大幅降低了约97.5%的成本。另一方面，与微生物单细胞基因组测序通常使用的不低于100x测序深度相比，使用改良的测序反应体积微缩化的方法仅需40x测序深度便可实现高质量的微生物单细胞全基因组序列组装。这种成本更为友好的改良型WGA-X™方法或将还有进一步降低成本的空间，激发更多科学家发起探索环境中稀有分类微生物群体和未知新型微生物基因组信息潜力的前沿研究。
-参考文献-
[1] High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome, Science, 2022
[2] A simplified improvement to multiple displacement amplification for microbial single-cell genomics, Int J Mol Sci, 2023