活细胞成像刷屏！一天两篇CELL揭秘神经退行性疾病和肿瘤免疫新疗法
时间：2024-09-26 阅读：189
在科学研究的前沿，赛多利斯的Incucyte®实时活细胞分析系统已成为众多CNS论文的常客（相关阅读：一天三篇CNS，Incucyte开启细胞研究新速度）。而在今年的9月13日，又有两篇CELL论文借助Incucyte®展示了更为丰富的数据。陈老师对此进行了深入分析，揭示了活细胞成像在这些研究中的关键作用，带来更加“可视化” 的科学视角。
01
植入“木马”分子治疗神经退行性疾病[1]
蛋白质聚集会导致广泛的神经退行性疾病。例如，在阿尔茨海默病患者的大脑中，tau蛋白和淀粉样蛋白错误折叠并积聚成细丝状聚集物。靶向和去除聚集体，而不是功能性蛋白，是一个相当大的挑战。本文发现了一种称为“RING-Bait”的治疗策略，RING是TRIM21蛋白的一个结构域，用来标记“垃圾”蛋白，并将其交由细胞的“垃圾处理工厂”蛋白酶体进行降解。Bait就是聚合蛋白的单体序列。RING-Bait融合蛋白与聚集蛋白序列结合，被募集到聚集体中，从而导致聚集体被蛋白酶体降解。RING-Bait可以特异性降解tau聚集体的同时保留可溶性 tau。
图1. RING-Bait示意图：RING-Bait作为tau聚集体的“木马”分子，介导tau聚集体的降解
本文使用了稳定表达与绿色荧光蛋白融合的 P301S 0N4R tau（病理突变的tau蛋白）的HEK293细胞（以下简称“TV 细胞”）。先前研究表明，在转染试剂作用下，TV细胞通过形成大而明亮的tau亮点状来响应外源供应的tau聚集体。可以通过Incucyte®实时活细胞分析系统来追踪tau 聚集体的生成（图2，3）。
图2. Incucyte®系统对tau 聚集体的亮点状进行圈描，并对其总面积进行计算（上图为原图，下图黄色区域为tau 聚集体的圈描）
图3. TV 细胞在 Incucyte®系统中拍摄72小时，每2-4小时拍摄一次照片并进行分析。左图为实时统计的tau聚集体面积，发现tau-RING可以减少tau的聚集；右图为终点计算结果
为了测试tau-RING是否依赖于泛素-蛋白酶体途径（UPS），及与内源性TRIM21相同的方式降解聚集体，加入E1 泛素激活酶抑制剂（TAK-243）、VCP抑制剂（NMS-873）和蛋白酶体抑制剂（MG-132）。这些抑制剂完全阻止了 tau-RING 介导的 TVA细胞tau聚集体降解，表明泛素化途径是必不可少的（图4）。
图4. Incucyte®测试发现加入泛素-蛋白酶体途径相关抑制剂，tau-RING对tau聚集体降解被阻止
为了达到RING-Bait序列的最佳效率，bait（诱饵）和基材（聚合蛋白单体序列）需要在结构上兼容，以便将诱饵有效地掺入目标聚集体中。在人类tau蛋白病中，不同疾病中的细丝由不同的tau亚型组成。在家族性tau蛋白病中，WT tau与突变tau的整合是突变依赖性的。因此探索了WT 0N4R tau-RING 在去除携带 P301S 突变聚集体的功效。WT 0N4R tau-RING 在降解 TVA 细胞中的聚集体方面不如 P301S 0N4R tau-RING 有效（图5）。这表明P301S 突变的 tau与WT tau自聚的效率比较低。
图5. Incucyte®测试发现WT 0N4R tau-RING 在降解 TVA细胞中的聚集体方面不如 P301S 0N4R tau-RING 有效
动物实验中，RING-Bait 去除了从阿尔茨海默病（AD）和进行性核上性麻痹（PSP）脑提取物中播种的 tau 聚集体，并延长了其存活时间。RING-Bait 策略可以通过替换 Bait 序列以匹配目标聚集体来应用于其他神经退行性疾病的治疗。
02
可能的下一代肿瘤免疫新疗法[2]
线粒体丢失和功能障碍会导致T细胞耗竭，这是基于T细胞的免疫疗法成功的主要障碍。本文发现骨髓基质细胞与T细胞建立纳米管连接，并利用这些细胞间高速公路将基质细胞线粒体移植到CD8 T细胞中。这些捐献线粒体的T细胞扩增更稳健，浸润肿瘤的效率更高，并且与不吸收线粒体的T细胞相比，表现出更少的耗竭迹象和增强的抗肿瘤反应。
为了评估线粒体转移是否也能提高人抗肿瘤 T 细胞疗效，研究使用Incucyte®评估了 CD19-CAR T细胞对荧光标记的 NALM6（一种侵袭性 CD19 人 B 细胞淋巴细胞白血病细胞系）的细胞毒能力。与 Mito-细胞（未注入线粒体）的T细胞相比，Mito+细胞（注入线粒体）的T细胞表现出显着增加的肿瘤杀伤能力，线粒体功能失调的T细胞（Mito EtBr）并没有增强抗肿瘤活性，证明在Mito+ T细胞的功能是由供体线粒体驱动的（图6A）。
为了确定线粒体转移是否赋予 CD19-CAR T 细胞对耗竭的抵抗力，评估了线粒体细胞在肿瘤细胞重复攻击下杀死 NALM6 细胞的能力。Mito+细胞在六轮刺激中保持对癌细胞的强大细胞毒活性，而 Mito-细胞在第三轮开始失去杀伤能力，到第六轮几乎完全耗尽了功能（图6B，6C）。
图6. Incucyte®系统每 2 小时测量一次肿瘤细胞的 GFP 荧光强度，共拍摄48-72小时；B为六轮杀伤结果，C为终点信号的拍摄的结果（肿瘤球）
移植健康线粒体的能力可能与 TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）应用特别相关，因为它们的内源性线粒体经常被肿瘤微环境中发现的敌对条件造成不可修复的损害。当用 SK23-GFP（一种表达靶抗原 MART-1 的黑色素瘤细胞系）和Mito- TIL或Mito+共培养。Mito+TILs介导的肿瘤清除率更高（图7）。为了探索供体线粒体是否也可以来自原代 BMSC（骨髓基质细胞），将 MART-1 TIL 与来自三个不同供体产生的临床级原代 BMSCs 共培养。Mito+ TILs 始终表现出对增强的靶癌细胞的细胞毒性 。
图7. 使用Incuyte®对Mito+和Mito-的TIL对SK1-GFP黑色素瘤的细胞毒性测定。（E：T比例1：5）。供体线粒体来源于永生化（I）或原代BMSC（J）
这些发现将细胞间线粒体转移确立为细胞器医学的原型，为下一代细胞疗法开辟了途径。
这些文章看中了
Incucyte®哪些优点呢？
培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害和移动；如第二篇文章就测试了6轮免疫细胞杀伤，耗时2周左右
多个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高；如第一篇文章就利用Incucyte®的高通量测试了多种抑制剂的影响
具有划痕，肿瘤球，类器官，趋化，血管生成等多个分析拍摄模块，并配套相应的耗材；如第二篇文章使用了肿瘤球模式层扫拍摄
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-参考文献-
[1] Co-opting templated aggregation to degrade pathogenic tau assemblies and improve motor function.cell
[2] Intercellular nanotube-mediated mitochondrial transfer enhances T cell metabolic fitness and antitumor efficacy.cell