Overview

生物污染控制策略是新标准和指导方针如EN17141及欧盟GMP附录1的修订版本的关键要求。欧盟和英国已采用了2020年发布的EN17141取代ISO14698。EN17141附录E章节对基于培养技术的微生物监测方法和取样器验证指南作了详细的说明。

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本篇《根据EN17141和ISO14698，使用凝胶膜过滤器进行洁净环境中的空气监测》应用说明重点关注活性微生物的监测，并证明通过凝胶膜过滤技术进行的微生物空气监测符合EN17141和ISO14698的要求。

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简介

无菌和生物制药生产中必须实施生物污染控制策略。要实现这些控制，就需要精心设计工艺流程以免污染、实施监测系统以监测污染、以及实施补救策略以迅速解决污染事件。

空气污染物可通过主动采样进行测量，而主动采样需要使用专业的设备主动抽取规定体积的空气。这便于准确测量每立方米（m3）的空气中的微生物菌落形成单位的数量（CFU）。

采样器效率可分为物理效率和生物效率。物理效率是采样器收集的微生物数量与取样空气体积中存在的总数量的比率。生物效率是从空气样本中回收的活性微生物数量与预期收集的数量的比率。

物理采样效率

枯草杆菌黑色变种芽孢（1.2μm x 0.8μm）是一种能够承受雾化压力的强健微生物。

在受控环境室中使用旋转顶部气溶胶发生器生成含有不同大小的活枯草芽孢杆菌孢子颗粒的微生物气溶胶。将含有 0 - 7 %（重量/体积百分比）碘化钾（Kl）的 80%乙醇的孢子悬浮液（约 106CFU/ml）注入气溶胶发生器中。颗粒的大小可通过旋转顶部的速度和悬浮液中的KI浓度来调节。与气溶胶发生器等距放置的采样器可同时采集样本。

截留率

通过使用雾化枯草芽孢杆菌孢子进行的细菌激发试验（BCT）测定出了凝胶膜过滤器的截留率。在BC试验中，使用了 1.2 * 105 CFU/cm² 枯草芽孢杆菌孢子来挑战凝胶过滤器，然后检测过滤后的空气是否受到枯草芽孢杆菌的污染。凝胶过滤器对枯草芽孢杆菌孢子的最高截留率 > 97.996%（图1）。

图1：用 1.2 * 105 CFU/cm²的枯草芽孢杆菌孢子进行激发试验后得出的凝胶膜过滤器截留率。

物理采样效率

结果表明，0.8μm和 16μm之间颗粒的收集效率没有显著的差异（图2）。

图2：与Casella狭缝取样器相比，凝胶膜过滤器在不同粒径的 1.2 * 105CFU/cm²枯草芽孢杆菌孢子激发时的物理取样效率。



生物采样效率

试验结果表明，凝胶膜过滤器可以可靠地收集空气中的携菌颗粒，且不会降低回收率。

通过从含有植物细菌的气溶胶中取样，并将其与实验室自然空气中的微生物回收率进行比较，测定出了凝胶过滤法的生物效率。

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌

通过喷洒在环境室内生成含有枯草杆菌黑色变种孢子（1.2μm x 0.8μm）和革兰氏阴性大肠杆菌（2μm x 1μm）混合物的气溶胶。结果表明，与Casella狭缝取样器相比，大肠杆菌与枯草芽孢杆菌孢子之间的比率没有显著差异（图3）。这也证实，基于凝胶膜过滤的空气采样不会对植物微生物的生存能力产生不利的影响。

图3.与Casella狭缝取样器相比，凝胶膜过滤器的悬浮大肠杆菌/枯草芽孢杆菌孢子生物取样效率。

连续微生物空气监测（8 h）

实验证明，在从环境空气中连续采样 8 小时后，与对照组相比，平均CFU计数没有显著的变化。此外，与仅 30 分钟的采样周期相比，微生物范围没有显著的变化（图4和图5）。

图4.与取样 30 分钟后直接放置在营养培养基上的凝胶过滤器相比（参照），取样（试验）8 小时后凝胶膜过滤器上的微生物回收率。

图5.在凝胶过滤器上取样 8 h（A）后与取样 30 min后直接放置在营养培养基上的凝胶过滤器（B）的回收菌种范围比较。



凝胶过滤法的优点

- 在特定时间内增加流速或延长采样时间，可进行大容量采样和/或长期采样，并在 8 小时内连续收集空气，而不会对微生物回收产生不利影响。

- 避免将营养培养基引入隔离器/灌装线。

- 营养培养基不会因脱水而造成水分流失。

- 由于凝胶膜过滤器容易溶解在琼脂表面，因此，可确保从孔结构中轻松回收微生物。

- 在典型工作班次 8 小时的取样期间，可避免操作员干预（例如，频繁更换培养基板）。

- 经证实的病毒截留率有助于监测空气中传播的外来病毒。

- 使用凝胶膜过滤器和快速检测法（PCR）。

空气采样器技术性能

MD8 Airscan® 经过专门的开发，主要用于洁净室环境，不会干扰气流模式。取样头可集成到关键控制点的隔离器、灌装线或其他洁净室环境中，并可进行等速取样。取样头（整个气流路径）可以通过汽化/气相过氧化氢（VHP）进行消毒。

采样量可通过空气流速来调节，并可通过集成式空气流量计来持续监控。凝胶膜过滤器具有多种配置，可满足每一种微生物检测需求。

MD8 Airscan®

Conclusion

实验结果证明，与Casella采样器相比，凝胶膜过滤器的截留率超过 97.996%，物理取样效率超过 80%。在EN17141和ISO14698标准中，膜过滤法被认定为高效生物取样的参考方法。尽管如此，我们还是将凝胶膜过滤法的生物效率与Casella取样器的生物效率作了比较，并证明，与Casella取样器相比，革兰氏阴性大肠杆菌与枯草芽孢杆菌孢子的比率没有差异。

即使经过 8 小时的采样期，凝胶膜过滤法的高生物采样效率仍保持不变。连续采样也不会对过滤器的平均CFU计数以及回收的微生物种类范围产生不利的影响。

结果表明，无需重新评价赛多利斯微生物空气监测仪器和耗材的功能，

并且凝胶膜过滤方法符合EN17141和ISO14698 的要求。该方法还符合欧盟GMP附录1，2020年修订版中关于活性颗粒环境监测的规范。

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